Use of genetic material extracted from rapid malaria diagnostic tests using PCR during the Grand Magal of Touba in Senegal

TL;DR

This study shows that genetic material from malaria rapid diagnostic tests can be used for more accurate PCR testing during a large religious event in Senegal.

Contribution

Demonstrates the feasibility of using leftover genetic material from rapid malaria tests for retrospective PCR confirmation.

Findings

Extracted genetic material from rapid diagnostic tests was successfully used for qPCR confirmation of malaria.

Bioline™ tests had higher specificity (97.3%) compared to ParaHIT® (92.5%).

PCR detected 8.1% positive cases, with ParaHIT® showing higher false positives (7.2%) compared to Bioline™ (2.5%).

Abstract

Le Grand Magal de Touba (GMT) est un événement religieux qui attire entre quatre et cinq millions de pèlerins et présente un risque important de transmission de maladies infectieuses dont le paludisme. L’utilisation des tests de diagnostic rapide (TDR) est habituelle lors de cet événement. L’objectif de cette étude était de valider l’utilisation du matériel génétique extrait des TDR pour la réalisation de tests diagnostiques rétrospectifs par PCR.

Deux types de TDR Bioline™ Malaria Ag P. f/Pan (Abbott, USA) et ParaHIT® (Arkray, Inde) utilisés pour la détection de Plasmodium falciparum ont été collectés dans huit structures sanitaires du département de Mbacké en 2022 et 2023 pendant le GMT. Une PCR en temps réel (qPCR) a été réalisée après ouverture des tests TDR et extraction de l’ADN/ARN pour confirmer la lecture visuelle des tests antigéniques. Les performances des TDR collectés ont été calculées par rapport à la PCR considérée comme test de référence.

2 381 TDR ont été collectés dont 213 TDR positifs (8,9%) d’après la lecture des tests (135 avec les tests Bioline™ et 78 avec les ParaHIT). En qPCR, 194 échantillons (8,1%) étaient positifs pour P. falciparum. Des faux positifs ont été notés dans 39 tests Bioline™ (2,5%) et 57 tests ParaHIT (7,2%) et des faux négatifs dans 68 tests Bioline™ (4,3%) et 9 tests ParaHIT (1,1%). Les tests Bioline™ et ParaHIT avaient des spécificités respectives de 97,3% et 92,5%, des valeurs prédictives positives de 71,1% et 26,9%, et des valeurs prédictives négatives de 95,3% et 98,7% respectivement.

Le matériel génétique extrait des cassettes TDR est utilisable pour réaliser ultérieurement des diagnostics par PCR avec une spécificité et une sensibilité accrue.

Figures

Full text

Introduction

Le Grand Magal de Touba (GMT) est un événement religieux organisé par la communauté mouride, une confrérie musulmane du Sénégal, célébré le 18 Safar de chaque année selon le calendrier musulman. Il attire entre quatre et cinq millions de pèlerins et présente un risque de transmission de maladies infectieuses, dont la propagation peut être favorisée par la densité de population des participants et la surpopulation des sites les plus fréquentés [3]. Une étude menée de 2018 à 2021 au centre de santé de Mbacké pendant le GMT a montré que sur un total de 141 patients, 45 (31,9%) ont été testés positifs pour au moins un pathogène sanguin, dont 21,3% pour Plasmodium falciparum, 5,7% pour Borrelia spp. et 5% pour le virus de la dengue [1]. Dans une nouvelle étude, il nous a paru intéressant de vérifier s’il était possible d’utiliser le matériel génétique des tests de diagnostic rapide (TDR) pour confirmer a posteriori par PCR le résultat de la lecture initiale.

Méthode

Pour notre étude, deux types de TDR utilisés pour le diagnostic du paludisme ont été collectées dans huit structures sanitaires du département de Mbacké pendant cinq jours au cours du GMT: le ParaHIT® (Akray Healthcare, Inde) et le Bioline™ Malaria Ag P. f/Pan (Abbott, États-Unis), qui détectent uniquement la protéine HRP2 de P. falciparum. Les acides nucléiques (ADN/ARN) ont été extraits des TDR à l’aide de l’instrument KingFisher™ Flex pour effectuer des tests de PCR quantitative en temps réel ciblant l’ARNr 18S de P. falciparum. Tous les essais de PCR quantitative en temps réel ont été réalisés à l’aide d’un thermocycleur C1000 Touch™ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en utilisant la trousse LightCycler® 480 Probes Master kit (Roche Diagnostics, France) conformément aux recommandations du fabricant. Des contrôles négatifs (mélange PCR) et positifs (ADN de souches bactériennes) ont été inclus dans chaque série. Un seuil de cycle (CT) 35 a été utilisé pour les résultats positifs après amplification. La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) des TDR du paludisme ont été calculées par rapport à la PCR considérée comme test de référence.

Résultats

Nous avons collecté 2 381 TDR, dont 1 586 testés par Bioline™ Malaria Ag P. f/Pan et 795 par des tests ParaHIT®. Leur lecture a révélé 213 (8,95%) échantillons positifs (135 pour Bioline™ Malaria Ag P. f/Pan et 78 pour ParaHIT®). En qPCR, 194 (8,15%) étaient positifs (164 pour Bioline™ Malaria Ag P. f/Pan et 30 pour ParaHIT® pour P. falciparum) (Tableau I). Les TDR ParaHIT® sont plus sensibles que les Bioline™ Malaria Ag P. f/Pan, mais leur spécificité est légèrement plus faible. Bien que la VPN des deux tests reste correcte, leur VPP est faible, voire médiocre pour le TDR ParaHIT® (Tableau I).

Tableau I: Sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive et valeur prédictive négative des deux types de TDR P. falciparum utilisés

Discussion

Les TDR présentent de nombreux avantages, tels que la rapidité des résultats (5-20 minutes maximum), la facilité d’interprétation et le faible coût. En outre, les TDR du paludisme ont permis de prendre en charge rapidement les patients fébriles, en fournissant un diagnostic probable du paludisme, de sorte que le traitement antipaludique a pu être administré à temps.

Des faux positifs du TDR de P. falciparum peuvent être causés par d’autres infections (dengue, toxoplasmose, hépatite C,…) ou des maladies autoimmunes. Des faux négatifs peuvent être dus à des infections pauci-parasitaires, des souches de P. falciparum ne sécrétant pas d’HRP2, d’autres espèces plasmodiales, à des erreurs de procédure ou à des tests altérés [2].

Notre étude présente certaines limites. Le délai entre la réalisation des TDR et l’analyse par PCR est long mais il peut être raccourci à l’aide d’une logistique appropriée. Bien que non formellement validée, la technique de récupération des antigènes est confortée par la cohérence des résultats. La différence des résultats des deux TDR entre eux, alors que leurs performances sont similaires, peut s’expliquer par des recrutements de patients et des conditions épidémiologiques du paludisme différents selon les centres de santé.

Néanmoins, l’approche consistant à rechercher directement l’ADN parasitaire par PCR dans le sang collecté sur le TDR lui-même, est originale et incite à réaliser de nombreux tests diagnostiques de fièvres non palustres.

Éthique

Le protocole a été approuvé par le Comité national d’éthique pour la recherche en santé au Sénégal (SEN17/62), et réalisé conformément aux bonnes pratiques cliniques recommandées par la déclaration d’Helsinki et ses amendements.

Financement

Cette étude est soutenue par l’Institut hospitalo-universitaire (IHU) Méditerranée Infection, l’Agence nationale de la recherche française dans le cadre du programme des Investissements d’avenir, référence ANR-10-IAHU-03.

Contribution des auteurs

C. D. a contribué à la conception expérimentale, a rédigé le manuscrit et a réalisé la technique qPCR. I. O. a contribué à la conception expérimentale. G. D. a collecté des échantillons et révisé le manuscrit. M. G. a réalisé la technique qPCR. A. S., D. F. et M. F. ont réalisé la dissection des TDR. P. G. a rédigé le projet original, a contribué à la conception expérimentale, a révisé le manuscrit et a coordonné le travail. C. S. a rédigé le projet original, a contribué à la conception expérimentale et a coordonné le travail.

Conflits d’intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.