HDAC6 inhibitor ACY-738 induces apoptosis and autophagy in diffuse large B-cell lymphoma cells through P53 acetylation

TL;DR

This study shows that the HDAC6 inhibitor ACY-738 can kill diffuse large B-cell lymphoma cells by inducing cell death and autophagy through P53 acetylation.

Contribution

The novel finding is that ACY-738 induces apoptosis and autophagy in DLBCL cells via P53 acetylation, offering a new therapeutic strategy.

Findings

HDAC6 is highly expressed in DLBCL, and ACY-738 inhibits cell proliferation and DNA synthesis in a dose-dependent manner.

ACY-738 increases ROS levels, induces mitochondrial damage, and promotes apoptosis and autophagy in DLBCL cells.

ACY-738 upregulates acetylated P53 and modulates key apoptotic and autophagy-related proteins.

Abstract

初步探讨组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）抑制剂ACY-738在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的抗肿瘤作用及其机制。

生信分析HDAC6在不同肿瘤及DLBCL中的表达。不同浓度ACY-738处理DLBCL细胞后，CCK-8检测细胞活力；EdU检测细胞DNA合成能力；软琼脂实验检测细胞克隆形成；荧光显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的水平；透射电镜观察细胞形态的变化；流式细胞术检测线粒体ROS和细胞凋亡水平；蛋白质印迹法（Western blotting）检测细胞凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白的表达水平。

HDAC6在DLBCL中高表达（P<0.05）。ACY-738抑制DLBCL细胞增殖、DNA合成及克隆形成，且呈剂量依赖性（P<0.05）。ACY-738处理后DLBCL细胞内ROS水平及线粒体ROS水平增加，且呈剂量依赖性（P<0.05）。电镜观察细胞形态，发现ACY-738处理后，细胞线粒体肿胀破裂，线粒体嵴减少或消失，出现自噬溶酶体，并观察到细胞凋亡形态；Western blotting结果显示ACY-738处理后，凋亡相关蛋白BCL-2表达下调，Cleaved-PARP、Cleaved caspase-3、BAX表达上调（P<0.05），自噬相关蛋白Atg7、Atg3、LC3B、P62表达下调，乙酰化P53蛋白表达上调（P<0.05）。

HDAC6抑制剂ACY-738通过乙酰化P53诱导线粒体依赖性细胞凋亡和自噬，从而抑制DLBCL细胞生长。

Figures

HDAC6在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的表达 A、B 采用GEPIA或GEO数据集分析HDAC6在DLBCL组织及正常组织中的表达；C HDAC6在正常细胞对照组和DLBCL细胞的蛋白表达注 与对照组（CN）比较，aP<0.05；bP<0.001

HDAC6抑制剂ACY-738抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）增殖 A-D ACY-738作用24 h后抑制OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞DNA合成能力；E、F ACY-738作用24 h后抑制OCI-LY1和SU-DHL-6细胞克隆形成能力注 与对照组（ACY-738 0 µmol/L）比较，aP<0.01；bP<0.001

HDAC6抑制剂ACY-738诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）氧化应激 A、B ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞活性氧水平变化；C、D ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞线粒体活性氧水平变化；E-H 活性氧水平变化统计图注 与对照组（ACY-738 0 µmol/L）比较，aP<0.01；bP<0.001

HDAC6抑制剂ACY-738诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）凋亡 A ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞凋亡率；B ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞凋亡相关蛋白的表达

HDAC6抑制剂ACY-738诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）自噬 A ACY-738作用24h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞自噬相关蛋白的表达；B ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞HDAC6及Acetyl-P53蛋白的表达；C HDAC6敲低后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞HDAC6及Acetyl-P53蛋白的表达注 CN：HDAC6未敲低细胞

Full text

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种侵袭性非霍奇金淋巴瘤，占所有淋巴瘤的30％～40％，亦是国内最常见的淋巴瘤类型[1]–[2]。目前DLBCL常用治疗策略为R-CHOP（利妥昔单抗+环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松）方案，但由于其高侵袭性与异质性等特点，致使约30％患者仍存在难治或复发情况[3]–[4]。因此，探索DLBCL新的治疗靶点及药物，对于降低DLBCL相关死亡率和提高总体生存率至关重要。

目前，已有多种组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，如伏立诺他、罗米地辛、西达本胺被批准用于治疗T细胞淋巴瘤[5]–[9]，但在B细胞淋巴瘤中仍处于探索阶段，研究表明，HDAC抑制剂恩替司他通过降低BCL-XL水平进而诱导B细胞淋巴瘤的半胱天冬酶依赖性凋亡[10]–[11]。HDAC抑制剂通过多种机制抑制肿瘤细胞增殖，包括上调死亡受体和促凋亡蛋白、诱导氧化应激、破坏细胞周期检查点和DNA修复等[12]。研究显示，HDAC6作为现有18种HDAC家族中的Ⅱb类成员[13]，具有成为治疗恶性肿瘤靶点的潜力，针对淋巴瘤所设计的HDAC6抑制剂也已处于临床试验中[14]。本实验将以DLBCL细胞为研究对象，探讨HDAC6抑制剂ACY-738对DLBCL的治疗效果及其机制，为HDAC6抑制剂在DLBCL临床治疗中的应用提供实验依据。

材料与方法

一、材料

1. 细胞：DLBCL细胞系SU-DHL-2、SU-DHL-6、OCI-LY1、OCI-LY3、Toledo、Pfeiffer购自广州吉尼欧生物科技有限公司。

2. 试剂与仪器：胎牛血清（FBS）和RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibco公司。IMDM细胞培养基购自以色列BI公司。二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。HDAC6抑制剂ACY-738及红色线粒体超氧化物荧光探针（Mito SOX Red）购自美国MCE公司。CCK-8购自日本同仁公司。Agarose购自瑞士Lonza公司。3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自美国Invitrogen公司。HDAC6腺病毒试剂购自中国上海汉恒生物公司。Annexin V-APC/7aad细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。EdU-594细胞增殖检测试剂盒、活性氧（ROS）、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白质印迹法（Western blotting）一抗稀释液和二抗稀释液、封闭液均购自中国碧云天生物技术有限公司。GAPDH、β-actin、Cleaved-PARP、Cleaved caspase-3、BCL-2、BAX、Acetyl-P53、Atg7、P62、Atg3、LC3B、HDAC6抗体及辣根过氧化物酶山羊抗兔二抗均购自美国CST公司。ECL发光试剂盒购自美国Millipore公司。多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司。正置荧光显微镜购自日本Olympus公司。流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。电泳仪、Chemi Doc XRS+Imager高灵敏度化学发光成像系统购自美国Bio-Rad公司。

二、方法

1. ACY-738的配制：ACY-738用DMSO配制成10 mmol/L母液，用1×PBS稀释成5、10、20 µmol/L工作液，−20 °C分装保存。

2. 细胞培养与分组：OCI-LY1、OCI-LY3细胞采用含20％ FBS的IMDM培养基，SU-DHL-6、SU-DHL-2、Toledo、Pfeiffer细胞采用含10％ FBS的1640培养基，在37 °C，5％ CO_2_细胞培养箱中培养细胞，取对数生长期细胞用于实验。后续实验根据ACY-738浓度分为对照组（0 µmol/L）和实验组（5、10、20 µmol/L）。

3. HDAC6在肿瘤中的表达分析：采用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）数据库分析HDAC6在不同肿瘤及DLBCL中的表达。采用GEO数据集GSE56315分析HDAC6在DLBCL组织和正常组织中的表达。

4. CCK8检测：细胞以1×10^4^个/孔接种于96孔板。加入不同浓度的ACY-738（0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 µmol/L）作用24 h，每组设置3个复孔，每孔加入CCK-8试剂10 µl，37 °C继续培养2 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度（A）值，并按照以下公式计算细胞抑制率。

细胞抑制率（％）＝（1−A实验组/A对照组）×100％

5. EdU检测：细胞以1×10^6^个/孔接种于6孔板，加入4种浓度的ACY-738（0、5、10、20 µmol/L）作用24 h后加入EdU工作液孵育2 h，随后用4％多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗3次后加入通透液孵育15 min，随后加入EdU反应液避光孵育30 min，PBS洗涤3次后，加入Hoechst 33342染色30 min，荧光显微镜下观察，随机选取3个视野拍照，计算阳性细胞率。

6. 软琼脂克隆形成实验：用培养基将3.5％ Agar胶稀释为0.7％的下层胶，以2 ml每孔的量加入6孔板中，4 °C静置15 min凝固。分别对OCI-LY1和SU-DHL-6细胞进行计数（3 000/孔），将细胞重悬于0.35％ Agar胶中，加入4种浓度的ACY-738（0、5、10、20 µmol/L），1.5 ml每孔，4 °C静置1～2 h凝固后，放入37 °C培养箱。2～3周后加入200 µl MTT，37 °C，5％ CO_2_孵育30 min后观察拍照，并对形成克隆进行计数。

7. ROS检测：细胞以1×10^6^个/孔接种于6孔板，加入4种浓度的ACY-738作用24 h后，收集细胞，PBS洗1次，加入终浓度为1 µmol/L的DCFH-DA工作液500 µl，室温避光孵育30 min后，PBS洗1次，加入Hoechst 33342染色30 min，荧光显微镜下观察，随机选取3个视野拍照，计算阳性细胞率。

8. 线粒体ROS检测：细胞以1×10^6^个/孔接种于6孔板，加入4种浓度的ACY-738作用24 h后，收集细胞，PBS洗1次，加入终浓度为1 µmol/L的Mito Sox Red工作液500 µl，室温避光孵育30 min后用流式细胞仪检测线粒体ROS变化。

9. 透射电镜检测：细胞以1×10^6^个/孔接种于6孔板，加入4种浓度的ACY-738作用24 h后，收集细胞，PBS洗1次，加入1 ml电镜固定液室温固定2 h，再转移至4 °C保存，后由武汉塞维尔生物科技有限公司完成后续检测。

10. 细胞凋亡检测：细胞以1×10^6^个/孔接种于6孔板，加入4种浓度的ACY-738作用24 h后，收集细胞，PBS洗1次，加入Annexin V-APC及7aad染料各2.5 µl，室温避光孵育30 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

11. HDAC6敲低细胞株构建：细胞以3×10^5^个孔接种于24孔板，加入2 µl shHDAC6腺病毒母液，吹打混匀5～10次，室温静置15 min后补300 µl培养基，在37 °C，5％ CO_2_细胞培养箱中培养2 d，通过荧光显微镜观察感染率。

12. 蛋白提取及Western blotting检测：细胞以1×10^6^个/孔接种于6孔板，加入4种浓度的ACY-738作用24 h后，收集细胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，13 400×g、4°C离心10 min后取上清。使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度并定量。加入蛋白上样缓冲液，100 °C金属浴加热10 min。电泳后将分离的蛋白转膜至PVDF膜上，快速封闭液封闭15 min，孵育一抗4 °C过夜，Cleaved-PARP、Cleaved caspase-3、BAX、BCL-2、Acetyl-P53、Atg7、Atg3、P62、LC3B、HDAC6稀释比例为1∶1 000，GAPDH、β-actin稀释比例均为1：3 000。二抗室温孵育2 h。配制显影液，化学发光仪显影并拍照。使用Image J软件检测蛋白条带灰度值。目的蛋白相对表达量以目的蛋白与内参灰度值的比值表示。

三、统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析与作图。数据以x±s表示，两组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用单因素方差分析，每次实验至少重复3次，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、生信分析HDAC6在DLBCL中高表达

生物信息学分析表明，HDAC6在DLBCL中高表达（P<0.05，图1A、B）。Western blotting结果表明，与对照相比，HDAC6高表达于DLBCL细胞，具体到不同的细胞系中，OCI-LY1（HDAC6/GAPDH：0.94±0.02）、SU-DHL-6（HDAC6/GAPDH：1.15±0.13）细胞差异均有统计学意义（均P<0.05，图1C）。提示HDAC6可能作为DLBCL的潜在治疗靶点。

HDAC6在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的表达 A、B 采用GEPIA或GEO数据集分析HDAC6在DLBCL组织及正常组织中的表达；C HDAC6在正常细胞对照组和DLBCL细胞的蛋白表达注 与对照组（CN）比较，aP<0.05；bP<0.001

二、ACY-738抑制DLBCL细胞增殖

采用CCK-8实验检测ACY-738对DLBCL细胞增殖的影响。结果表明，与对照组相比，ACY-738作用24 h后SU-DHL-2、SU-DHL-6、OCI-LY1、OCI-LY3、Toledo、Pfeiffer细胞增殖能力明显受到抑制，且在OCI-LY1、SU-DHL-6细胞中呈现剂量依赖性，即浓度越高，细胞增殖抑制性越强（P<0.05）。因此，选用OCI-LY1、SU-DHL-6细胞进行后续实验。ACY-738作用24 h后通过对药物半数抑制浓度（IC_50_）进行拟合，OCI-LY1细胞IC_50_为7.33 µmol/L、SU-DHL-6细胞IC_50_为12.03 µmol/L。EdU结果表明，ACY-738给药组能够显著降低OCI-LY1、SU-DHL-6细胞的DNA合成能力（P<0.05，图2A-D）。软琼脂克隆结果表明，与对照组相比，ACY-738给药组能够显著抑制OCI-LY1、SU-DHL-6细胞克隆形成（P<0.05，图2E、F）。以上结果表明ACY-738可以抑制DLBCL细胞增殖。

HDAC6抑制剂ACY-738抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）增殖 A-D ACY-738作用24 h后抑制OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞DNA合成能力；E、F ACY-738作用24 h后抑制OCI-LY1和SU-DHL-6细胞克隆形成能力注 与对照组（ACY-738 0 µmol/L）比较，aP<0.01；bP<0.001

三、ACY-738诱导DLBCL细胞线粒体损伤

通过荧光显微镜检测ACY-738作用后DLBCL细胞内ROS水平的变化。结果表明，与对照组相比，ACY-738处理后细胞ROS水平增加，且呈剂量依赖性（P<0.01，图3）。进一步通过流式细胞术检测ACY-738作用后DLBCL细胞线粒体ROS变化。结果表明，与对照组相比，ACY-738处理后线粒体ROS呈剂量依赖性增加（P<0.001，图3）。以上结果表明，ACY-738可以诱导线粒体氧化损伤，导致ROS产生及线粒体超氧化物增加。

HDAC6抑制剂ACY-738诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）氧化应激 A、B ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞活性氧水平变化；C、D ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞线粒体活性氧水平变化；E-H 活性氧水平变化统计图注 与对照组（ACY-738 0 µmol/L）比较，aP<0.01；bP<0.001

通过透射电镜对线粒体形态进行观察，与对照组相比，ACY-738处理后线粒体发生明显异常如肿胀、破裂，线粒体嵴断裂甚至消失。同时观察到ACY-738作用后DLBCL细胞中出现自噬溶酶体，此外，在高浓度组观察到明显的细胞凋亡形态。以上结果说明，ACY-738可能通过诱导线粒体损伤导致细胞发生凋亡和自噬。

四、ACY-738诱导DLBCL细胞凋亡

通过流式细胞术检测ACY-738作用后的细胞凋亡率。结果显示，与对照组相比，ACY-738处理后细胞凋亡率增加，且呈现剂量依赖性［ACY-738浓度为0、5、10、20 µmol/L时，OCI-LY1和SU-PHL-6细胞凋亡率分别为（9.57±0.33）％、（19.23±1.11）％、（47.30±0.36）％、（53.03±0.38）％；（11.28±0.75）％、（21.43±0.97）％、（29.43±1.10）％、（32.73±0.15）％］，其中以高浓度组最为显著，这与电镜结果一致（P<0.001，图4A）。Western blotting结果表明，ACY-738处理后，Cleaved-PARP、Cleaved caspase-3表达上调、抗凋亡蛋白BCL-2表达下调、促凋亡蛋白BAX表达上调（P<0.05，图4B）。以上结果表明，ACY-738通过调控BCL-2/BAX表达诱导细胞发生线粒体依赖的细胞凋亡。

HDAC6抑制剂ACY-738诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）凋亡 A ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞凋亡率；B ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞凋亡相关蛋白的表达

五、ACY-738诱导DLBCL细胞自噬

Western blotting结果表明，ACY-738处理后，Atg3、Atg7表达下调，LC3B、P62表达显著下调（P<0.05，图5A）。说明ACY-738可以诱导DLBCL细胞发生自噬。进一步对其上游调控机制进行探索，研究发现，ACY-738处理后，P53乙酰化水平上调（P<0.05，图5B）。HDAC6敲低后，也得到了相似的结果（P<0.05，图5C）。以上提示ACY-738通过抑制HDAC6的表达，进而乙酰化激活P53，导致细胞发生凋亡和自噬。

HDAC6抑制剂ACY-738诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞（OCI-LY1、SU-DHL-6细胞）自噬 A ACY-738作用24h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞自噬相关蛋白的表达；B ACY-738作用24 h后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞HDAC6及Acetyl-P53蛋白的表达；C HDAC6敲低后OCI-LY1细胞和SU-DHL-6细胞HDAC6及Acetyl-P53蛋白的表达注 CN：HDAC6未敲低细胞

讨论

HDAC6是HDAC家族成员之一，与多种肿瘤的发生发展密切相关[15]–[16]。抑制HDAC6的表达和功能是一种有前景的肿瘤治疗策略[17]–[18]。研究显示，ACY-738与伊布替尼联合用药可以延长慢性淋巴细胞白血病患者的总生存期，表明ACY-738在血液系统恶性肿瘤中具有一定的治疗前景[19]。本研究发现HDAC6在DLBCL中高表达，因此，我们推测HDAC6可能作为DLBCL的潜在治疗靶点。

本研究进一步发现ACY-738可诱导DLBCL细胞线粒体发生氧化损伤。此外，在电镜中观察到自噬溶酶体产生及明显的细胞凋亡形态，说明ACY-738抑制DLBCL细胞增殖可能与线粒体氧化损伤介导的凋亡和自噬有关。凋亡是一种程序性细胞死亡方式，其发生途径包括线粒体途径、内质网途径以及死亡受体途径。BCL-2是线粒体途径的重要凋亡调控因子，当线粒体发生氧化损伤时，抗凋亡蛋白BCL-2活性受到抑制，促凋亡蛋白BAX活性增强，从而释放凋亡因子，激活caspase-3，进一步激活效应PARP，启动caspase级联反应，最终导致细胞凋亡发生[20]–[21]。本研究发现，ACY-738处理后细胞凋亡率增加，BCL-2蛋白表达下调，BAX、Cleaved caspse-3、Cleaved-PARP蛋白表达上调。提示ACY-738可以通过线粒体依赖途径诱导DLBCL细胞发生凋亡。

自噬是维持细胞内环境稳态的生理过程，其中LC3是公认的自噬标志物，具有控制自噬膜形成和自噬体与溶酶体融合的功能。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-Ⅱ被切割，产生LC3-Ⅰ循环利用；内膜上的LC3-Ⅱ被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量降低[22]。在自噬活动中，Atg3、Atg7作为LC3泛素样偶联系统中重要组成成分，在液泡近端层次上募集，并组织成为对自噬体形成至关重要的前自噬体结构[23]。此外，P62作为连接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶降解。在持续的应激状态及持续进展的自噬作用下，胞质中出现大量自噬溶酶体，降解胞内物质，导致细胞由于过度的自我损耗而死亡，即自噬性细胞死亡。本研究结果表明，ACY-738作用后，Atg3、Atg7、LC3、P62蛋白表达均下调，提示ACY-738可以诱导DLBCL细胞发生自噬性细胞死亡。

P53作为重要的抑癌基因，参与调控肿瘤细胞凋亡和细胞自噬等生理病理过程。当细胞处于DNA损伤或氧化应激时，P53通过磷酸化或乙酰化修饰激活，激活的P53蛋白参与多种基因的转录，如BAX、PUMA等，从而诱导细胞发生凋亡。此外，P53还可以促进肿瘤抑制因子PTEN的表达，进一步抑制mTOR的活性从而诱导自噬[24]–[25]。考虑到ACY-738为HDAC6的抑制剂，我们推测，ACY-738可能通过表观遗传调控DLBCL细胞凋亡和自噬。本研究发现ACY-738作用后，可以乙酰化激活P53，从而诱导细胞发生P53依赖的凋亡及自噬。

综上所述，本研究发现HDAC6抑制剂ACY-738可以调控P53介导的细胞凋亡和自噬，从而抑制DLBCL细胞增殖。但本研究尚有不足之处，未在动物体内进一步验证ACY-738的药效学评价，本研究初步明确了ACY-738有潜力成为抗DLBCL的靶向药物，但其分子机制仍需进行深入探索。