Advancements in CRISPR-Cas9 for Fanconi anemia

TL;DR

CRISPR-Cas9 has made significant progress in treating Fanconi anemia, but challenges like off-target effects and ethical issues remain.

Contribution

The paper reviews recent advances and challenges of CRISPR-Cas9 in Fanconi anemia gene therapy.

Findings

CRISPR-Cas9 and base editing have enabled precise repair of common FA mutations.

Challenges include tumor risk, chromosomal instability, and off-target effects.

Future work should focus on optimizing sgRNA and Cas9 to reduce off-target effects.

Abstract

范可尼贫血（FA）是一种以基因组不稳定和对DNA交联剂敏感为特征的遗传性骨髓衰竭综合征。近年来，CRISPR-Cas9技术在FA的基因治疗领域取得了突破性进展。传统CRISPR-Cas9技术在FA基因编辑中已得到成功应用，单碱基编辑技术基于CRISPR/Cas9系统，能够对FA患者中常见的基因突变进行精准、高效的基因修复；尽管引导编辑技术提供了新的基因编辑可能性，但目前在FA中的应用尚未开展。FA基因编辑技术虽取得了显著进步，但仍面临诸多挑战，包括收集足够的造血干细胞、基因编辑后增加肿瘤发生风险、染色体不稳定、脱靶效应等。未来研究应聚焦在优化单链向导RNA和Cas9核酸酶、设计更严格的PAM序列方式等减少脱靶效应，设计个性化的基因编辑策略。伦理与监管问题和长期随访同样也是今后开展基因编辑工作的重点。随着技术的不断进步和临床试验的深入，我们有望在未来看到CRISPR-Cas9技术在FA治疗中取得更多的突破。本文就常用的CRISPR技术在FA治疗领域的最新研究进展展开综述，并分析了该技术在FA基因治疗中的优势与挑战。

Figures

Full text

范可尼贫血（Fanconi anemia, FA）是一种以常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传（FANCR/RAD51）或X连锁（FANCB）遗传的骨髓衰竭疾病，具有先天性发育异常、进行性骨髓衰竭和肿瘤易感性等临床特征[1]。FA/BRCA通路主要负责识别DNA链间交联（interstrand cross-linking, ICL）并参与同源重组修复（homology directed repair, HDR）[2]–[3]，该通路23个基因中的任何一个发生突变都可能导致FA发病[4]–[5]。在所有已知的基因突变中，FANCA基因的双等位基因突变最为常见，约占所有FA患者的60％[6]–[7]。

造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）仍然是目前治疗FA患者唯一的根治性方法，3年生存率约为80％[8]–[9]。然而，因HLA匹配供者有限，故并非所有患者都有条件接受HSCT。此外，移植物抗宿主病（GVHD）[10]–[11]和移植后远期实体瘤[12]–[13]使部分患者无法从HSCT中获益。因此，针对FA患者的发病机制，最理想的治疗方案是通过基因治疗修复突变基因。与HSCT相比，基因治疗可为无合适HLA供者的患者提供新的方案，亦可最大程度减少移植后排异及远期实体瘤的发生，从而显著提升患者的生活质量。但由于FA患者造血干细胞（HSC）数量较少、基因编辑技术限制，导致FA基因治疗不能在临床广泛应用。2023年末，首个基于CRISPR的基因编辑疗法CASGEVY（exa-cel）[14]获批，标志着基因编辑技术正式进入了一个新时代。本文就CRISPR-Cas9技术在FA中的研究进展作一综述。

一、CRIPSR-Cas9基因编辑技术的作用机制

CRISPR-Cas9系统源于细菌和古细菌为应对外来入侵而进化出的防御机制[15]，主要通过单链向导RNA（single guide RNA, sgRNA）和Cas9蛋白组成。sgRNA包括CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA），负责引导Cas9蛋白靶向特定的DNA序列。Cas9蛋白含有HNH和RuvC两个关键结构域：HNH切割与sgRNA互补的链，RuvC结构域切割非互补链。Cas9在sgRNA引导下，识别前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM），并在PAM位点上游3~5个碱基处切割DNA，产生双链断裂（double strand breaks, DSB）。双链断裂后细胞将进一步进行修复，修复机制主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）两种方式。NHEJ是较常见的修复途径[16]，可以快速融合两个断裂的DNA末端（图1），但容易在靶位点发生随机插入或缺失，导致基因失活；HDR则利用同源供体DNA，能实现精准的插入、缺失或碱基置换，但效率较低[17]–[18]。HDR依赖功能性FA途径，FANCD1/BRCA2、FANCN/PALB2、FANCO/RAD51C、FANCR/RAD51、FANCS/BRCA1和FANCU/XRCC2等多个FA相关基因都发挥着重要作用[19]。

二、CRISRR-Cas9技术在FA治疗中的应用

1. 传统的CRISPR-Cas9技术在FA中的应用：CRISPR-Cas9技术在FA基因治疗中取得了一些突破性进展（表1）。

Osborn等[20]首次在FA患者成纤维细胞中，通过补充FA相关的DNA修复途径并结合嘌呤霉素抗性筛选，成功纠正了FANCC基因的c.456+4 A>T突变，基因编辑效率约2％，这是CRISPR-Cas9技术在FA基因编辑中的首次成功应用。在后续的研究中，他们又在FA患者的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）中，利用nCas9（D10A）和DNA质粒作为供体模板，对FANCI基因的c.1461 A>T突变进行了基因校正[21]，通过三轮丝裂霉素C（mitomycin C, MMC）筛选，基因编辑效率达到了66％，经基因校正后的iPSC成功分化为具有HSC特性的CD34^+^CD38^-^细胞。Skvarova Kramarzova等[22]研究团队则从1例患有复合杂合突变（886delGT和6162insT）的FA患者的皮肤活检样本中提取成纤维细胞，设计了单链寡核苷酸（ssODN）作为HDR模板，通过CRISPR-Cas9系统修复了FANCD1基因的886delGT突变，利用PARP抑制剂进行细胞筛选后，基因编辑效率约为23％。

尽管HDR介导的基因编辑在FA细胞中取得一定的成功，但其基因编辑效率普遍较低，且需要特定的筛选策略。因此，研究者开始探索NHEJ路径在FA细胞中恢复FANC蛋白功能的可能性。van de Vrugt等[23]利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，对FA患者的FANCF基因突变进行了深入研究。他们发现，通过CRISPR-Cas9诱导的DSB触发NHEJ修复路径，无需外部模板，便可有效修复FANCF基因突变，经编辑的细胞在MMC的处理下存活率提升了27％。此外，该团队还在小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, mESC）中进行了HDR修复途径，尽管其基因编辑效率较低（≤6％），但经过基因编辑的胚胎干细胞在增殖方面展现出了明显的优势。在Román-Rodríguez等[24]的研究中，通过CRISPR-Cas9技术激活NHEJ机制，成功修复了FA患者HSC中的FANCA、FANCC、FANCD1等关键基因突变：利用CRISPR-Cas9系统在靶基因上引入DSB，利用NHEJ修复路径产生补偿性插入/缺失突变，恢复了基因的阅读框，从而纠正了突变基因的功能缺陷，经过编辑的细胞在体外（实验室培养）和体内（小鼠模型移植）实验中均展现出显著的增殖优势。

2. 单碱基编辑技术的应用：传统CRISPR-Cas9技术对单碱基突变的校正精准度较差，为了克服这方面的挑战，科研人员开发了单碱基编辑技术（base editing）。这项技术包括胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE）[27]–[29]，它们能够在不引起DNA双链断裂的情况下，利用与脱氨酶融合的nCas9，直接在目标基因位点实现C>T（G>A）或A>G（T>C）的碱基转换。相较于传统方法，这一技术更为精准、高效和安全。Moriarty实验室利用单碱基编辑技术成功修正了FANCA基因的突变，恢复了FANCA蛋白的正常表达，通过FANCD2的单泛素化验证了FA信号通路的完整，并且经过基因校正的细胞对MMC的抵抗力得到了显著增强[25]。Corn实验室则采用了改进型的ABE8e版本，优化了sgRNA的设计，成功修复了FANCA基因中的两种常见突变——FA-75和FA-55，实现了70％~80％的基因编辑效率[26]。

3. 引导基因编辑技术：引导基因编辑技术（prime editing）[30]是目前基因编辑领域的最新突破，通过其独特的“搜索与替换”机制，能够精确地执行所有12种可能的碱基编辑，包括置换、插入和缺失。这一技术超越了传统单碱基编辑器的局限，能够实现A到T或C到G的碱基颠换。这项技术尚未应用于FA治疗领域，但这种技术的发展为FA的治疗提供了新的方向。

三、CRISPR-Cas9技术的局限性及未来研究方向

CRISPR-Cas9技术在治疗FA方面展现出巨大的潜力，但其临床应用仍面临一些挑战。首先，收集足够的HSC是基因治疗成功的关键。研究表明，使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和普乐沙福（plerixafor）动员HSC对尚未出现骨髓衰竭的FA患者是安全且有效的[31]，然而，大多数FA患者在确诊时已出现显著的全血细胞减少，使HSC的收集难度大幅增加[32]。提示我们对于FA患者应该在还未出现骨髓衰竭前或者在骨髓衰竭早期尽快收集HSC，这将有利于后期行基因治疗。其次，FA患者因DNA修复机制缺陷，CRISPR-Cas9引发的DSB难以有效修复，导致基因组大片段的缺失和染色体重排[33]–[34]，增加肿瘤发生风险，这种风险在具有长期自我更新能力的HSC中尤为显著。尽管单碱基编辑和引导编辑技术不产生DSB，然而编辑过程中产生的单链损伤仍可能引发染色体不稳定。此外，基因编辑技术的脱靶效应[35]也是影响其安全性的关键，特别是在DNA修复功能受损的FA患者中，脱靶效应可能诱发严重的基因组损伤。为提高基因编辑的安全性，未来研究应聚焦以下几方面：优化sgRNA和Cas9核酸酶、设计更严格的PAM序列、优化递送方式、限制核酸酶的表达时间及开发更精确的脱靶检测技术[36]等。今后是否可以通过寻找可通用的非FA患者靶细胞克服FA患者DNA修复机制缺陷值得我们探索。此外，针对FA患者不同的基因突变类型，基因编辑策略需个体化设计，以实现最佳治疗效果。对于常见点突变，单碱基编辑和引导编辑技术可实现高效的基因矫正；但对于复杂的突变或大片段缺失，传统CRISPR-Cas9可能更具优势。这就要求我们熟练掌握各种基因编辑技术的优劣，并根据突变情况合理选择。

临床治疗工作中，伦理与监管问题亦必须重视。在推进基因编辑技术的同时，须确保其应用符合伦理标准和监管要求。接受CRISPR-Cas9治疗的患者需进行长期随访，以评估潜在的长期风险[37]。这就要求我们设立专有机构进行监督与评估。

四、结语

CRISPR基因编辑技术作为革命性的基因编辑工具，在FA的治疗中展现出巨大潜力。尽管仍存在许多挑战，但相信随着基因编辑技术的不断优化，最终FA基因治疗将会在临床中得到推广。