A clinical investigation of constructing a diagnostic model for sepsis-induced coagulopathy utilizing data-independent acquisition proteomics

TL;DR

This study uses proteomics to identify biomarkers and build a diagnostic model for sepsis-induced coagulopathy.

Contribution

A novel diagnostic model for SIC is developed using DIA proteomics and machine learning techniques.

Findings

240 differentially expressed proteins were identified in SIC patients.

A diagnostic model using angiogenin and lectin family member 10 achieved an AUC of 0.896.

Key pathways include natural killer cell-mediated cytotoxicity and TNF signaling.

Abstract

采用数据非依赖型采集（DIA）蛋白质组学技术分析脓毒症性凝血病（SIC）的血浆蛋白表达，筛选典型生物标志物并构建诊断模型。

前瞻性观察研究纳入重症医学科46例成年脓毒症患者，收集临床资料并按照SIC标准分为普通脓毒症组（26例）和SIC组（20例），采集血浆标本进行蛋白组学检测并进行生信物信息学分析，应用LASSO、随机森林筛选差异表达蛋白（DEP），根据筛选结果构建SIC诊断模型，并进行受试者工作特征（ROC）曲线分析。

基线资料显示，SIC患者的凝血酶原时间较脓毒症组明显延长，血小板计数明显降低，D-二聚体、纤维蛋白降解产物、血乳酸、SOFA评分和APACHE Ⅱ评分较脓毒症组患者明显升高（P<0.05）。DIA蛋白组学共鉴定出2 637个蛋白，以表达倍数>1.5倍且P<0.05为筛选标准，共筛选出240个DEP，包括81个上调DEP和159个下调DEP。亚细胞定位分析表明，DEP主要在细胞外和细胞核；GO注释显示，DEP在生物过程方面主要参与细胞生理、生物调节和应激反应过程；分子功能方面主要参与生物分子互作和催化作用；结构域注释显示DEP以免疫球蛋白V区为主，是特异识别和结合抗原的部分；KEGG富集分析显示，DEP主要富集在自然杀伤细胞介导的细胞毒性反应、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路、肿瘤坏死因子信号通路和NF-κB信号通路。对DEP进行LASSO回归和随机森林，筛选出血管生成素、凝集素家族成员10两个变量，且以此构建的SIC诊断模型的ROC曲线下面积为0.896，特异度为0.731，灵敏度为0.900。

由血管生成素、凝集素家族成员10构建的诊断模型可准确诊断SIC。

Figures

蛋白的鉴定和质控及差异蛋白筛选与聚类分析 A 韦恩图显示脓毒症与SIC重叠蛋白；B 样本强度定量抖动分布图；C 火山图（红色标注上调蛋白，蓝色标注下调蛋白，标示出差异最显著的前10个蛋白）；D 聚类分析图（240个差异蛋白在脓毒症与SIC中分别聚为两个独立的簇，表明差异蛋白在两组之间存在显著的表达模式差异）注 SIC：脓毒症性凝血病样本；QC：质控样本

240个差异蛋白的生物信息学分析结果 A 亚细胞定位分析；B 结构域注释；C GO功能注释；D KEGG富集

差异蛋白（DEP）的变量筛选过程 A 应用LASSO回归筛选变量（通过λ对变量进行筛选，最终纳入11个DEP）；B 应用随机森林模型筛选变量（绿色表示重要变量，红色表示不重要变量，黄色为暂定变量，蓝色代表阴影属性的最小、平均和最大Z值，最终筛选出18个重要DEP）；C 韦恩图筛选LASSO和随机森林中共有的重要标志物；D 相关性分析（将相关系数绝对值大于0.4的蛋白剔除1个以避免出现功能相似标志物）

脓毒症性凝血病（SIC）诊断模型的效能评价 A SIC诊断列线图；B 校准曲线；C 临床决策曲线；D 受试者工作特征（ROC）曲线

Tables

表1. 脓毒症与脓毒症性凝血病（SIC）患者的基线资料

指标	脓毒症组（26例）	SIC组（20例）	统计量	P值
年龄［岁，M（Q1, Q3）］	78.5（59.5, 87）	83（71, 84.5）	−0.189	0.850
男性［例（％）］	17（65.38）	10（50.00）	1.104	0.293
WBC［×109/L，M（Q1, Q3）］	7.20（5.78, 10.15）	15.00（9.63, 15.80）	−3.503	<0.001
ALC（×109/L，x±s）	0.88±0.39	0.91±0.55	−0.227	0.822
ANC［×109/L，M（Q1, Q3）］	5.75（4.78, 8.35）	12.85（7.85, 14.95）	−3.458	<0.001
RBC（×1012/L，x±s）	3.55±0.88	3.28±0.97	0.971	0.338
PLT（×109/L，x±s）	205.30±47.40	98.15±74.92	5.593	<0.001
PT［s，M（Q1, Q3）］	13.1（12.2, 14.2）	17.6（16.4, 18.7）	−5.420	<0.001
APTT［s，M（Q1, Q3）］	33.4（27.6, 38.5）	35.7（30.3, 46.9）	−1.571	0.080
TT［s，M（Q1, Q3）］	16.2（14.8, 16.8）	17.3（14.9, 19.6）	−1.497	0.134
FIB（g/L，x±s）	3.99±0.90	2.82±0.92	4.331	<0.001
纤维蛋白降解产物［µg/ml，M（Q1, Q3）］	3.39（2.46, 4.08）	6.63（4.09, 9.18）	−4.321	<0.001
D-二聚体［µg/ml，M（Q1, Q3）］	1.04（0.825, 1.68）	2.63（1.45, 4.10）	−4.144	<0.001
肌酐［µg/ml，M（Q1, Q3）］	70.35（45.05, 95.30）	101.40（74.15, 159.73）	−2.726	0.006
丙氨酸转氨酶［U/L，M（Q1, Q3）］	41.50（26.23, 64.35）	48.01（14.70, 62.78）	−0.244	0.807
天冬氨酸转氨酶［U/L，M（Q1, Q3）］	38.3（25.6, 55.5）	47.4（29.2, 67.1）	−0.909	0.364
C反应蛋白［mg/L，M（Q1, Q3）］	53.8（36.9, 114.7）	79.2（44.5, 181.0）	−0.997	0.319
乳酸［mmol/L，M（Q1, Q3）］	1.5（1.3, 1.9）	2.3（1.4, 3.1）	−2.359	0.017
SOFA评分［M（Q1, Q3）］	5.00（3.75, 7.00）	9.00（6.00, 11.00）	−4.037	<0.001
APACHE Ⅱ评分（x±s）	18.69±4.60	22.35±4.67	−2.655	0.011

Full text

脓毒症是指宿主对感染的异常反应导致的致死性器官功能障碍[1]。美国每年约170万成人发生脓毒症，约60余万在院内死亡[2]。中国重症医学质控中心报道，在重症医学科收治的成人脓毒症性休克患者的在院死亡率超过50％[3]。脓毒症时感染和炎症因素极易导致血管内皮损伤，从而发生以血小板减少、凝血紊乱和纤溶异常为特征的脓毒症性凝血病（Sepsis-induced coagulopathy, SIC）[4]。据统计，我国67.9％的脓毒症患者可合并SIC，SIC易进展为弥散性血管内凝血（DIC），导致SIC患者死亡率显著升高[5]–[6]。为了实现SIC患者的早期诊断，国际血栓与止血学会（International Society on Thrombosis and Haemostasis，ISTH）专门发布了由序贯器官衰竭评分（SOFA评分）、INR和血小板计数三个指标组成的SIC诊断积分法[7]。SIC诊断标准的最大优点是纳入指标非常普及，临床易于执行，但也导致SIC诊断标准的灵敏度和特异度不够理想[8]。因此，寻找更加灵敏、准确的诊断标志物一直是SIC的研究热点之一。

数据非依赖型采集（DIA）蛋白质组学能大规模检测蛋白质，具有高定量准确性和高数据重现性，已被广泛用于挖掘疾病机制、筛选早期诊断标志物和发现治疗靶点的相关研究，但在SIC方面尚未见报道[9]。因此，本研究拟采用DIA蛋白组学技术检测SIC患者血浆中蛋白表达的变化，探讨SIC的发病机制并筛选有意义的差异表达蛋白（Differentially expressed proteins，DEP），为早期精准诊断SIC提供依据。

病例与方法

一、研究对象和分组

本研究属于前瞻性观察性研究，共纳入2023年11月至2024年5月联勤保障部队第九〇八医院重症医学科收治的46例脓毒症患者。纳入标准：符合脓毒症3.0诊断标准[10]。排除标准为符合以下任意一条：①年龄<18岁；②转入ICU不足24 h或转出患者；③血液系统肿瘤患者；④既往肝病病史；⑤既往遗传性凝血异常。根据是否满足中国SIC诊断标准[11]，将46例脓毒症患者分为普通脓毒症组（26例）和SIC患者（20例）。本研究经联勤保障部队第九〇八医院伦理委员会批准（伦理批号：908yyLL028），并征得患者家属知情同意。

二、收集基础资料

收集患者的基础资料包括年龄、性别，入科2 h内的血常规（包括白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、红细胞计数和血小板计数），血生化（包括肝肾功能指标，具体为丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素和肌酐），C-反应蛋白，乳酸，常规凝血指标（包括凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、纤维蛋白原、纤维蛋白原降解产物和D-二聚体），并计算入科时的急性生理与慢性健康（Acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）评分和SOFA评分。

三、蛋白提取与酶解

血浆复融离心后，加入适量裂解液提取蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。各样品分别取20 µg蛋白质加入适量缓冲液，沸水浴5 min，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色。所有样品取适量蛋白，混合成Pool样品，用于构建spectral library，并采用过滤辅助样品制备法酶解。酶解后样品肽段进行高pH反相肽分离。肽段冻干后加入40 µl 0.1％甲酸溶液复溶，通过280 nm处的吸光度（A）值测定样品的肽段浓度。Pool样品肽段和酶解肽段中分别加入适量iRT标准肽段，进行DIA质谱检测。

四、质谱分析

采用纳升流速Evosep one系统（丹麦Evosep公司产品）进行色谱分离，纳米级高效液相色谱分离后的样品用timsTOF质谱仪（德国布鲁克公司产品）进行DIA质谱分析。DIA数据采用Spectronaut软件进行数据处理。搜库（UniProt）完成后，对结果进行样本质控评价、定量分析和DEP筛选。DEP筛选标准：以差异倍数（Fold change，FC）>1.5、P<0.05作为显著上调的变化阈值，FC<−1.5、P<0.05为显著下调的变化阈值。

五、生物信息学分析

对DEP进行亚细胞结构注释、结构域注释、GO注释、KEGG通路富集分析。

六、统计学处理

所有临床数据采用SPSS 27.0统计软件进行分析。计数资料以构成比或频数表示，组间比较采用χ^2^检验。计量资料以单样本S-W法进行正态分布检验，符合正态分布的数据以均数±标准差（x±s）表示；非正态分布的数据以中位数（四分位数）［M（Q1，Q3）］表示。满足正态分布且方差齐者组间比较采用t检验；不满足者组间比较采用Mann-Whitney U检验。以P<0.05为差异有统计学意义。使用R包“random Forest”进行随机森林。对DEP使用CNSknowall平台进行LASSO回归、受试者工作特征（Receiver operating characteristic, ROC）曲线分析、列线图和决策曲线分析的绘制。

结果

一、基线资料

如表1所示，炎症指标中，SIC患者的白细胞计数和中性粒细胞计数较脓毒症组上升。器官功能方面，SIC患者的肌酐水平增高，提示肾功能受损。疾病危重程度的评估上，SIC患者的血乳酸浓度、SOFA评分和APACHE Ⅱ评分均高于脓毒症组，表明病情更加严重。凝血功能方面，SIC患者的凝血酶原时间延长，血小板计数、纤维蛋白原水平显著降低，而D-二聚体、纤维蛋白降解产物水平升高，提示存在明显的凝血功能障碍。

表1: 脓毒症与脓毒症性凝血病（SIC）患者的基线资料

二、差异表达蛋白的筛选

质谱检测结果以韦恩图显示共鉴定到2 637个重叠蛋白（图1A），本项目所有样本及质量控制（QC）样本内蛋白的定量强度分布以抖动图形式展示如下（图1B）。以FC>1.5、P<0.05为上调蛋白变化阈值，FC<−1.5、P<0.05为下调蛋白变化阈值，共筛选出240个DEP，其中上调蛋白81个，下调蛋白159个。以FC值和P值两个因素为标准绘制火山图（图1C），以热图形式采用层次聚类算法对DEP进行聚类分析（图1D）。

蛋白的鉴定和质控及差异蛋白筛选与聚类分析 A 韦恩图显示脓毒症与SIC重叠蛋白；B 样本强度定量抖动分布图；C 火山图（红色标注上调蛋白，蓝色标注下调蛋白，标示出差异最显著的前10个蛋白）；D 聚类分析图（240个差异蛋白在脓毒症与SIC中分别聚为两个独立的簇，表明差异蛋白在两组之间存在显著的表达模式差异）注 SIC：脓毒症性凝血病样本；QC：质控样本

三、生物信息学分析

对所有DEP进行亚细胞定位分析，结果显示DEP主要在细胞外和细胞核（图2A）。结构域注释结果显示，差异蛋白结构域绝大多数聚集在免疫蛋白的V区（图2B）。GO功能注释显示，在生物过程方面DEP主要参与细胞生理、生物调节、应激反应过程、免疫反应过程，在分子功能方面DEP主要参与生物分子互作和催化作用；在细胞组成方面主要分布在细胞外区域（图2C）。KEGG通路富集分析结果显示，DEP主要富集在自然杀伤细胞介导的细胞毒性、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路、肿瘤坏死信号通路和NF-κB信号通路（图2D）。

240个差异蛋白的生物信息学分析结果 A 亚细胞定位分析；B 结构域注释；C GO功能注释；D KEGG富集

四、生物标志物筛选

为寻找有临床价值的诊断标志物，首先对240个DEP进行初筛。排除无基因名称的免疫球蛋白片段后，采用LASSO回归进行筛选，当Log（λ）为−3.23时共筛选出11个DEP（图3A），随机森林筛选出18个DEP（图3B），两种方法重叠出6个DEP（图3C）。对这6个蛋白进行相关性分析（图3D），将相关系数绝对值大于0.4的蛋白剔除1个以避免出现功能相似标志物，筛选出P03950（血管生成素）和A0A024R9J3（凝集素家族成员10）。

差异蛋白（DEP）的变量筛选过程 A 应用LASSO回归筛选变量（通过λ对变量进行筛选，最终纳入11个DEP）；B 应用随机森林模型筛选变量（绿色表示重要变量，红色表示不重要变量，黄色为暂定变量，蓝色代表阴影属性的最小、平均和最大Z值，最终筛选出18个重要DEP）；C 韦恩图筛选LASSO和随机森林中共有的重要标志物；D 相关性分析（将相关系数绝对值大于0.4的蛋白剔除1个以避免出现功能相似标志物）

五、诊断模型的构建

针对血管生成素和凝集素家族成员10蛋白构建SIC诊断模型并绘制列线图（图4A）。校准曲线显示平均绝对误差0.04（图4B）。临床决策曲线分析显示该预测模型的临床效益良好（图4C）。该诊断模型的ROC曲线下面积为（AUC）0.896，特异度为0.731，灵敏度为0.900（图4D）。

脓毒症性凝血病（SIC）诊断模型的效能评价 A SIC诊断列线图；B 校准曲线；C 临床决策曲线；D 受试者工作特征（ROC）曲线

讨论

本研究在国内外率先应用DIA蛋白组学筛选SIC患者早期诊断标志物。经生物信息学分析证实，SIC患者的240个DEP主要参与凝血异常、免疫反应和炎症通路，由LASSO回归和随机森林分析发现主要DEP为血管生成素和凝集素家族成员10。由其构建的SIC诊断模型的AUC为0.896，灵敏度为0.900，特异度为0.731。2024年，Shen等[12]报道针对22例脓毒症患者和10名健康人进行蛋白组学研究，经鉴定发现174个DEP，其功能主要集中于炎症反应、细胞外基质的代谢、细胞分泌物的分泌、细胞的活化和免疫反应。应用该研究筛选出的骨桥蛋白1诊断脓毒症的AUC为0.878。2024年12月，Palmowski等[13]报道224例存活和139例死亡的脓毒症患者，经鉴定发现的87种DEP功能主要集中于血液凝固、免疫反应和补体激活有关。其使用随机森林模型预测脓毒症30 d生存率的AUC为0.75。与同类研究相比，本研究针对脓毒症是否合并凝血病分组，与死亡脓毒症、普通脓毒症和健康人的相关数据分析可知，随着脓毒症的病情加重，凝血异常和免疫紊乱明显加重。本研究得出的SIC诊断模型效能也明显优于同类研究。

血管生成素是核糖核酸酶超家族成员，由123个氨基酸组成，循环浓度约400 ng/ml，因其能促进血管生成而得名，目前发现血管生成素具有较强的抗炎活性[14]。血管生成素能抑制成纤维细胞生成TNF-α，进而降低NF-κB、IL-6、IL-8和TNF-α受体等表达水平，从而发挥抗炎作用[15]。作为原始的核糖核酸酶，血管生成素还具有促进凝血因子活化的作用[16]。此外，血管生成素能够在微摩尔浓度下对白色念珠菌、肺炎链球菌和结核分枝杆菌产生杀菌效应。凝集素家族成员10是整合素家族成员，主要在肝脏、肾上腺、胸腺、脊髓和肾脏中表达，可在免疫反应和炎症过程中发挥关键作用[17]。凝集素家族成员10是一种模式识别受体，能够通过病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）和损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMP），促进免疫细胞的激活，从而增强宿主对感染的反应。与健康对照者相比，脓毒症患者的血浆Collectin-10可显著升高[18]。在新冠病毒感染患者中，凝集素家族成员10被报道能促进组织因子的表达和凝血酶原的活化，调节血小板功能[19]。此外，肝衰竭患者血浆Collectin-10水平也会显著升高，且升高者发生门静脉血栓的风险也更高[20]。本研究筛选出的主要DEP血管生成素和凝集素家族成员10主要集中在凝血异常和免疫紊乱的病理生理过程，这也说明SIC的主要病理生理机制是炎症与凝血障碍的交互作用。

本研究的不足之处主要有以下几点：第一，所筛选标志物均基于质谱方法测定，还需经过酶联免疫吸附法等多种实验方法验证结果及参考值范围。第二，本模型主要基于单中心研究数据，还未经过外部验证。第三，本研究的样本量相对偏小。

综上所述，本研究基于DIA蛋白组学筛选典型DEP，构建使用凝集素家族成员10和血管生成素组建的SIC诊断模型是全新高效的SIC诊断工具。