The traditional Chinese medicine Lulongzaisheng decoction alleviates aplastic anemia in mice by regulating the Jak2/Stat3/Acsl4 signaling pathway

TL;DR

This study shows that Lulongzaisheng decoction, a traditional Chinese medicine, helps treat aplastic anemia in mice by reducing iron death and improving bone marrow function.

Contribution

The study identifies the Jak2/Stat3/Acsl4 signaling pathway as a novel target for Lulongzaisheng decoction in treating aplastic anemia.

Findings

Lulongzaisheng reduced bone marrow fat and improved hematopoiesis in AA mice.

The decoction lowered lipid ROS and 4-HNE levels, indicating reduced iron death.

It inhibited the Jak2/Stat3 pathway and reduced Acsl4 expression in AA mice.

Abstract

探讨鹿龙再生汤对再生障碍性贫血（AA）模型小鼠铁死亡的影响及其对AA的潜在作用机制。

以近交系雌性BALB/c小鼠作为对照（对照组），应用IFN-γ腹腔注射联合白消安灌胃的方法建立AA小鼠模型组，并使用鹿龙再生汤对AA组连续灌胃10 d治疗，评估其对Jak2/Stat3/Acsl4信号通路的影响。胸骨组织病理学观察各组小鼠骨髓损伤程度；流式细胞术检测骨髓细胞中脂质活性氧（ROS）的产生；免疫组织化学染色观察胸骨中4-HNE的表达；Western blot法分析Jak2、p-Jak2、Stat3、p-Stat3及Acsl4的蛋白表达水平；ELISA法检测外周血IL-6水平。

与对照组相比，AA组小鼠骨髓腔内造血组织减少，脂肪化明显；AA+鹿龙再生汤组小鼠骨髓脂肪化减少。对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组骨髓细胞脂质ROS比例分别为（47.01±3.07）％、（53.81±1.99）％、（49.50±3.98）％（P<0.05），AA+鹿龙再生汤组的脂质ROS累积量较AA组略低。对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组骨髓腔内4-HNE的表达面积分别为（6.34±1.07）％、（35.26±3.68）％、（16.97±1.30）％（P<0.05），与AA组相比，AA+鹿龙再生汤组在骨髓4-HNE累积上显著减少。与对照组相比，AA组脾脏中铁死亡相关蛋白Acsl4表达升高，p-Stat3、p-Jak2表达上调；AA+鹿龙再生汤组Acsl4表达下调，p-Stat3、p-Jak2表达被抑制（P<0.05）。对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组外周血血浆IL-6的表达量分别为（65.60±6.01）、（166.50±3.32）、（119.37±4.29）pg/ml（P<0.05），AA+鹿龙再生汤组较AA组IL-6水平明显降低。

鹿龙再生汤通过调控铁死亡相关的基因Jak2/Stat3/Acsl4途径对AA模型小鼠具有显著的治疗效果。作用机制涉及抑制Jak2/Stat3信号通路以及调控Acsl4的表达，从而改善AA模型小鼠的造血功能。

Figures

对照组、再生障碍性贫血（AA）组、AA+鹿龙再生汤组小鼠胸骨组织病理学结果（HE染色，低倍） A 正常BALB/c小鼠；B AA组小鼠；C AA+鹿龙再生汤组小鼠

对照组、再生障碍性贫血（AA）组、AA+鹿龙再生汤组小鼠胸骨4-HNE免疫组化结果 A 正常BALB/c小鼠；B AA小鼠；C AA+鹿龙再生汤小鼠

对照组、再生障碍性贫血（AA）组、AA+鹿龙再生汤组小鼠脾脏中铁死亡相关基因和Jak2/Stat3信号通路的蛋白表达水平（nsP≥0.05、*P<0.05、P<0.01、*P<0.001）注 １：对照组；２：AA组；3：AA+鹿龙再生汤组

Full text

再生障碍性贫血（AA）的病理特点是骨髓内造血细胞被脂肪细胞替代，脂肪细胞对造血干细胞的成熟与分化起到负性调控作用[1]。针对重型AA（SAA）患者，HLA相合同胞供者的造血干细胞移植（MSD-HSCT）仍然是40岁以下患者的首选治疗方案；对于不适合一线MSD-HSCT的患者，通常采用免疫抑制治疗（IST）联合TPO受体激动剂（TPO-RA），并可考虑增加其他促造血治疗[2]。鹿龙再生汤是朱良春先生针对AA的经典经验方，在临床上应用多年并取得良好效果[3]。我们的先前实验结果显示，鹿龙再生汤可以调节AA小鼠外周血单个核细胞及脾效应T细胞的T-bet和GATA-3基因表达[4]；能抑制AA小鼠CD4^+^CD25^+^调节性T细胞（Treg）Stat3的磷酸化并上调Foxp3表达，发挥免疫调节作用[5]；改善骨髓中红系爆式集落形成单位（BFU-E）和粒-单核系集落形成单位（CFU-GM）的生成[6]，最终促进血细胞的恢复。这些发现初步揭示了鹿龙再生汤在AA治疗中的作用机制。

铁死亡（Ferroptosis）是一种新型细胞程序性死亡形式，其特征是脂质活性氧（ROS）的致死性积聚，在形态学、生化和遗传学方面不同于其他传统形式的细胞死亡如凋亡、坏死和自噬[7]。近年来发现铁死亡在骨髓衰竭性疾病发病中起一定作用。本研究旨在观察鹿龙再生汤对AA小鼠铁死亡相关基因的影响，以进一步探讨该方改善AA小鼠造血功能的机制。

对象与方法

1. 实验研究对象：近交系雌性BALB/c小鼠，清洁型，8～12周龄，体重18～22 g，由南通大学医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK（苏）2020-0009。通过IFN-γ腹腔注射及白消安灌胃8 d诱导建立AA小鼠模型[8]。

2. 实验分组：取12只AA模型小鼠，随机分为2组，每组6只，造模后第8天开始灌胃处理，分别予PBS、鹿龙再生汤连续灌胃10 d，即为AA组、AA+鹿龙再生汤组。另取6只正常BALB/c雌性小鼠设为对照组，PBS连续灌胃10 d。每组灌胃量均为0.01 ml/g。

3. 实验仪器和试剂：RPMI 1640培养基、PBS（美国Gibco公司）；小鼠源性重组IFN-γ（美国Peprotech公司）；白消安、4-HNE抗体、H₂DCFDA染料（美国MCE公司）；红细胞裂解液、4％多聚甲醛（北京兰杰柯科技有限公司）；ELISA试剂盒（江苏艾迪生生物科技有限公司）；HE染料套装、EDTA抗原修复液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；鹿龙再生汤（南通大学附属医院中医科）；兔抗小鼠GAPDH（杭州华安生物技术有限公司）；Jak2、p-Jak2、Stat3、p-Stat3一抗（美国CST公司）；Acsl4、Acsl3一抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；Slc7a11一抗（上海萨博生物技术有限公司）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）；Western blot仪（美国Bio-Rad公司）；冰冻切片机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；酶标仪（美国BioTek公司）。

4. 骨髓组织病理形态学及免疫组化检测：骨髓组织标本常规方法进行固定、脱钙、脱水、石蜡包埋等操作，切成4～6 µm厚的切片。组织病理形态：HE染色，显微镜观察。免疫组化：将切片浸入pH 9.0的EDTA缓冲液中，微波高火煮沸后转低火维持10 min，经封闭及一抗、二抗孵育后，滴加DAB显色，显微镜观察后终止染色，PBS洗3次。苏木素复染细胞核3 min，蒸馏水冲洗，分化液分化5 s，自来水冲洗至返蓝。脱水、透明、封片，显微镜观察。

5. 流式细胞术检测脂质ROS：将一侧股骨置于RPMI 1640培养基的培养皿中，切除两端后，用1 ml注射器抽取RPMI 1640培养基冲洗骨髓，重复3～4次。冲洗液经尼龙滤网过滤，裂红后用PBS重悬细胞，再通过70 µm Falcon细胞滤网过滤，得到骨髓单个核细胞悬液。取500 µl悬液，加入0.5 µl H_2_ DCFDA染料，振荡混匀，室温避光孵育30 min。孵育后加入1 ml流式染色缓冲液，离心弃上清，用300 µl缓冲液重悬细胞后避光保存，上机检测。

6. Western blot：取0.1 g鼠脾脏组织于1.5 ml EP管，加1 ml裂解液（RIPA∶PMSF＝100∶1），冰上剪碎后超声破碎，冰上裂解30 min后离心取上清。用BCA法测蛋白浓度，根据蛋白浓度调整上样量后进行SDS-PAGE电泳，转膜后常温5％牛奶封闭2 h，PBS洗涤3次，每次15 min。加一抗4°C冰箱孵育过夜。次日PBS洗涤后室温孵育二抗2 h，再次洗涤，显影。实验重复3次。

7. ELISA：将小鼠血样从EDTA抗凝管转移至2 ml的EP管中，离心收集上层血浆。将铝箔袋在室温下平衡20 min后，取出所需酶标板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 µl。样本孔先加待测样本10 µl，再加样本稀释液40 µl，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的IL-6检测抗体100 µl，用封板膜封住反应孔，37 °C恒温箱温育60 min。弃液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次，接着每孔加入TMB底物A、B各50 µl，37 °C避光孵育15 min后加入终止液50 µl，使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值，根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，计算样品中IL-6的浓度。

8. 统计学处理：使用GraphPad Prism 10.2.3绘图并进行统计学。数据来自至少3次独立实验，结果以x±s表示，两组间比较采用双尾非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1. 小鼠胸骨组织病理学观察：骨髓HE染色示AA组小鼠骨髓损伤明显，髓腔内造血组织减少，出现较大脂滴空泡，脂肪化明显；AA+鹿龙再生汤组小鼠的骨髓有部分恢复，髓腔内造血组织有增加，脂滴空泡减少（图1）。

对照组、再生障碍性贫血（AA）组、AA+鹿龙再生汤组小鼠胸骨组织病理学结果（HE染色，低倍） A 正常BALB/c小鼠；B AA组小鼠；C AA+鹿龙再生汤组小鼠

2. 小鼠骨髓细胞脂质ROS水平的变化观察：流式细胞术检测结果提示AA组与对照组相比脂质ROS发生累积，AA+鹿龙再生汤组的脂质ROS累积量较AA组略低。对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组脂质ROS比例分别为（47.01±3.07）％、（53.81±1.99）％、（49.50±3.98）％（P<0.05）。

3. 小鼠胸骨免疫组织化学染色观察：与对照组相比，AA组小鼠胸骨中4-HNE表达显著升高，提示造模后氧化应激反应增强；AA+鹿龙再生汤组4-HNE表达水平降低，表明氧化应激反应得到部分缓解（图2）。对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组骨髓腔内4-HNE的表达面积分别为（6.34±1.07）％、（35.26±3.68）％、（16.97±1.30）％（P<0.05）。

对照组、再生障碍性贫血（AA）组、AA+鹿龙再生汤组小鼠胸骨4-HNE免疫组化结果 A 正常BALB/c小鼠；B AA小鼠；C AA+鹿龙再生汤小鼠

4. 小鼠脾脏中铁死亡相关基因和Jak2/Stat3信号通路的蛋白表达比较：对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组Acsl3的相对表达水平分别为0.8±0.06、0.37±0.11、0.85±0.11；Acsl4的相对表达水平分别为0.96±0.13、1.24±0.12、0.81±0.15；Slc7a11的相对表达水平分别为1.02±0.05、0.54±0.14、0.95±0.04；Jak2的相对表达水平分别为0.18±0.03、0.44±0.02、0.44±0.01；p-Jak2的相对表达水平分别为0.51±0.05、1.35±0.11、0.62±0.06；Stat3的相对表达水平分别为0.77±0.07、1.27±0.08、0.66±0.07；p-Stat3的相对表达水平分别为0.38±0.04、1.17±0.17、0.46±0.04（图3）。与对照组相比，AA组铁死亡相关蛋白Acsl4表达升高，Acsl3、Slc7a11表达下降，p-Stat3、p-Jak2表达上调；AA+鹿龙再生汤组Acsl4表达下调，Acsl3、Slc7a11表达上调，p-Stat3、p-Jak2表达被抑制（P<0.05）。

*对照组、再生障碍性贫血（AA）组、AA+鹿龙再生汤组小鼠脾脏中铁死亡相关基因和Jak2/Stat3信号通路的蛋白表达水平（nsP≥0.05、*P<0.05、**P<0.01、**P<0.001）注 １：对照组；２：AA组；3：AA+鹿龙再生汤组

5. 小鼠外周血血浆中IL-6的变化比较：对照组、AA组、AA+鹿龙再生汤组外周血浆IL-6的表达量分别为（65.60±6.01）、（166.50±3.32）、（119.37±4.29）pg/ml（P<0.05）。与对照组相比，AA组IL-6水平升高，而AA+鹿龙再生汤组IL-6水平降低。

讨论

AA是一种严重的骨髓衰竭性疾病，主要表现为骨髓造血功能受损、全血细胞减少，其发病机制涉及复杂的免疫反应，异常活化的T淋巴细胞在该过程中发挥着主导作用。近来的研究发现巨噬细胞在AA的发病过程中也起着重要作用[9]–[10]。我们过去研究通过AA模型小鼠实验观察到，巨噬细胞和病理性T细胞在疾病末期会归巢至骨髓，并表现出强烈的免疫攻击活性，伴随免疫抑制功能的显著下降[10]–[11]。AA患者在初诊时通常伴有血清铁和铁蛋白水平的显著升高，这一现象不仅与铁利用障碍有关，也与巨噬细胞在铁代谢中的作用相关。巨噬细胞通过回收衰老红细胞中的铁，导致Fe^2+^的过量积累，铁过载进一步抑制骨髓造血功能及加剧骨髓造血干细胞的铁死亡[12]–[13]。同时巨噬细胞与Stat3之间也存在密切联系。Stat3是一种关键的转录因子，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及免疫反应等多种生物过程，对细胞存活和生长具有促进作用。研究表明Stat3既能促进巨噬细胞的抗炎和免疫抑制功能，也能够调节其参与免疫反应的能力[14]。Stat3在铁死亡的发生中也起着重要作用，与多种与铁死亡相关的基因（如Slc7a11、Fth1、Acsl4、Gpx4）存在紧密的相互作用[15]–[17]。其中，Stat3的过度激活可能通过促进Acsl4的表达，进而促进脂质过氧化过程，推动铁死亡的发生[17]。Stat3还能调节铁代谢，尤其是在与铁调节蛋白的相互作用过程中，其激活可能通过改变铁的平衡，间接影响铁死亡的发生[18]。因Stat3的信号异常在AA的发病机制中起重要作用，而我们过去的研究已证实鹿龙再生汤能够通过抑制CD4^+^CD25^+^ Treg细胞中Stat3的磷酸化来调节免疫反应，进而改善造血功能，但其中具体下游作用机制仍不明确[5]。基于以上研究，本研究我们观察了鹿龙再生汤对Stat3下游及铁死亡通路的影响，旨在进一步探讨鹿龙再生汤改善造血的具体机制。

Jak-Stat通路在细胞信号转导中发挥着关键作用，尤其是在将外部化学信号传递至细胞核并调控DNA转录和活性方面。Jak2广泛表达于多种组织，特别是在骨髓、淋巴组织、肺和胆囊。Jak2通过结合同型二聚体受体调节骨髓细胞的增殖与存活，在造血干细胞的自我更新和分化中起重要作用[19]。Stat3的过度激活可能导致细胞异常增殖和凋亡调控失衡[20]。已有研究指出，Jak2/Stat3信号通路异常激活会影响红细胞的生成[21]，且与多种细胞因子（如IL-6和IL-11）的信号传递密切相关。在AA中，IL-6的水平通常会升高，这与炎症反应、免疫激活及骨髓抑制有关，IL-6不仅促进其他炎症细胞因子的释放，还可能对造血干细胞的功能和生存产生负面影响，从而干扰造血[22]。在AA患者中，Th1和Th17细胞群体通常表现出扩增和激活，而Th2和Treg细胞的数量和功能则下降。已有研究表明，抑制Jak2/Stat3通路能够调节炎症条件下Treg细胞的稳定性，并减少Th17细胞的数量和功能[23]，这与我们之前的研究鹿龙再生汤可恢复Treg细胞的功能的结论相一致。既往我们的研究还发现，AA模型中Th17的极化现象明显[24]，而最新的研究则揭示，极化的Th17细胞通过促炎细胞因子的分泌，能够进一步激活IL-6/Jak3/Stat3信号通路[25]。本实验我们观察到AA模型中IL-6水平升高、Jak2和Stat3的磷酸化被激活，推测可能是由于造血微环境中负性因子的增多，激活了Jak2/Stat3信号通路，从而抑制了骨髓造血功能。鹿龙再生汤可通过抑制IL-6的产生，进而抑制Jak2/Stat3信号通路的激活，恢复了骨髓造血功能。

铁死亡中脂质过氧化的累积是核心机制。PE作为一种关键磷脂，主要由花生四烯酸及其衍生物与乙醇胺组成，能够诱导细胞发生铁死亡。Acsl4在PE的合成和重塑中发挥着重要作用，其可激活多不饱和脂肪酸（PUFA），进而影响细胞膜的特性。当细胞内Acsl4的表达水平降低时，多不饱和脂肪酸的可用性减少，进而抑制脂质过氧化和铁死亡的发生[26]。Poindessous等[17]报道，Acsl4的启动子区域富含Stat3结合位点，Stat3可以调控Acsl4的表达。本实验我们观察到AA模型小鼠特异性铁死亡相关基因Acsl4上升，同时Stat3也出现了异常激活。因而我们推测AA小鼠异常激活的Stat3可能通过促进Acsl4的高表达，导致了造血细胞铁死亡的发生。在AA+鹿龙再生汤组中，Stat3的磷酸化水平降低，进一步影响了下游Acsl4的表达。因此推测鹿龙再生汤治疗AA的机制可能是通过抑制Stat3的磷酸化，间接减少Acsl4的表达，从而抑制铁死亡的发生而发挥作用的。

铁死亡过程中，脂质ROS的水平通常会升高。4-HNE作为重要脂质过氧化标志物也会大量积聚。其他相关基因和蛋白表达也会出现变化，如Acsl3、Slc7a11。本实验中我们还观察到AA小鼠模型4-HNE水平增加、脂质ROS水平的升高及特异性铁死亡标志物Acsl3和Slc7a11的表达水平下降，进一步确认了AA模型小鼠造血细胞铁死亡的存在。在AA+鹿龙再生汤组中，4-HNE水平下降，脂质ROS水平随之下降，其他特异性铁死亡标志物Acsl3和Slc7a11的表达水平上升，这也进一步证实了鹿龙再生汤可以通过减轻铁死亡，从而改善造血功能。

尽管本研究采用的是动物模型，但这些发现初步表明铁死亡可能是AA发病机制中的一个重要环节，而鹿龙再生汤可以通过减轻造血干细胞铁死亡改善造血，部分阐明了鹿龙再生汤治疗AA的机制。