Establishment of a chronic lymphocytic leukemia mouse model via adoptive transfer of Eµ-TCL1 transgenic splenocytes

TL;DR

Researchers created a mouse model for chronic lymphocytic leukemia by transferring genetically modified spleen cells into wild-type mice, resulting in disease symptoms.

Contribution

A novel, short-cycle chronic lymphocytic leukemia mouse model was established using adoptive transfer of Eµ-TCL1 transgenic splenocytes.

Findings

The AT group showed significant spleen and liver enlargement compared to the WT group.

AT group mice exhibited increased peripheral blood white blood cell counts and B lymphocyte percentages.

Pathological and flow cytometry analyses confirmed CLL-like features in the AT group.

Abstract

利用免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞过继性转移（AT）至野生型（WT）小鼠体内，建立一种具有自身免疫功能、成模周期较短的慢性淋巴细胞白血病（CLL）小鼠模型。

实验使用了无特定病原体（SPF）级健康的C57BL/6J WT小鼠和H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA基因敲入小鼠。通过CRISPR/Cas9技术构建了H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA基因敲入小鼠，并采用PCR方法鉴定小鼠的基因型。实验动物被随机分为AT组和WT组，每组10只，AT组为H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA基因敲入小鼠脾细胞腹腔注射至体内的WT小鼠。监测小鼠的体重和一般情况，并在移植后第9周进行颈椎脱臼处死。通过病理学表现、外周血白细胞变化和免疫表型等关键指标对CLL小鼠模型进行疾病验证。

AT组脾重量为（0.92±0.16）g、肝重量为（2.11±0.56）g；WT组脾重量为（0.06±0.01）g、肝重量为（1.42±0.13）g，AT组出现明显的肝（P＝0.006）、脾（P<0.05）肿大。AT组外周血白细胞数量较WT组明显增多［（124.33±8.74）×109/L对（5.55±1.67）×109/L，P＝0.002］；AT组外周血B淋巴细胞百分比较WT组增多［（69.13±6.88）％对（39.78±5.94）％，P<0.05］。病理组织学检查发现AT组小鼠的脾、淋巴结、骨髓出现CLL病理表现，肝、肺、肾组织均有明显淋巴细胞浸润。流式细胞术检测结果示AT组CD19+CD5+ B淋巴细胞占淋巴细胞百分比在外周血、骨髓和脾中分别为（61.37±9.92）％、（28.61±7.08）％、（86.03±5.78）％；WT组CD19+CD5+ B淋巴细胞占淋巴细胞百分比在外周血、骨髓和脾中分别为（4.51±1.32）％、（5.58±1.46）％、（14.33±3.2）％；AT组外周血、骨髓、脾中CD19+CD5+ B淋巴细胞占比较WT组增多，差异均具有统计学意义（均P<0.05），且CD43、CD200表达阳性，但CD20、CD22、CD79b的表达低于WT组。

通过Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞AT，成功建立了成型周期相对较短的CLL小鼠模型，其可作为一种理想的临床前模型用于CLL相关疾病研究。

Figures

H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA小鼠基因敲入示意图注 Kozak-ATG：Kozak序列-ATG起始密码子；HTCL1A CDS：人源TCL1A基因编码序列；Β-globin-PolyA：β-珠蛋白-PolyA信号序列；TGA：终止密码子

Eµ-TCL1转基因小鼠样本PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 A 引物1扩增产物条带（681 bp）；B 引物2扩增产物条带（647 bp）；C 引物3扩增产物条带（825 bp）注 Eµ-TCL1：免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1；条带从左到右依次为Marker（M）、野生型（WT）、编号为21、22、23、24、25、26、27小鼠样本的PCR产物条带

过继性转移（AT）组和野生型（WT）组小鼠脏器（×100，HE染色）注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

过继性转移（AT）组和野生型（WT）组小鼠脏器（×100，HE染色）注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

过继性转移（AT）组和野生型（WT）组外周血涂片 A AT组外周血涂片低倍（×100）；B WT组外周血涂片低倍（×100）；C AT组外周血涂片高倍（×1 000）；D WT组外周血涂片高倍（×1 000）注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

流式细胞术检测过继性转移（AT）组和野生型（WT）组CD19+CD5+ B淋巴细胞占淋巴细胞百分比 A AT组外周血CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；B WT组外周血CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；C AT组脾CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；D WT组脾CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；E AT组骨髓CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；F WT组骨髓CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

流式细胞术检测过继性转移（AT）组和野生型（WT）组外周血CD43和CD200的表达情况 A AT组外周血CD43表达情况；B AT组外周血CD200表达情况；C WT组外周血CD43表达情况；D WT组外周血CD200表达情况注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

流式细胞术检测过继性转移（AT）组和野生型（WT）组外周血CD20、CD22和CD79b的表达情况 A AT组外周血CD20表达情况；B AT组外周血CD22表达情况；C AT组外周血CD79b表达情况；D WT组外周血CD20表达情况；E WT组外周血CD22表达情况；F WT组外周血CD79b表达情况注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的野生型小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的野生型小鼠

Full text

慢性淋巴细胞白血病（CLL）以成熟的CD5^+^ B细胞在血液、骨髓、脾和淋巴结中克隆性增殖并大量聚集为特征，通常发生在老年患者中[1]。目前关于CLL的发病机制尚未明确，付春玲等[2]和赵子璇等[3]利用人类CLL细胞株MEC-1建立了CLL小鼠模型，但其因免疫缺陷而无法进行CLL免疫机制的研究。因此，寻找一种具有自身免疫功能的CLL小鼠模型至关重要。免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠模型是迄今为止唯一显示出淋巴结肿瘤浸润的CLL小鼠模型，并且在小鼠体内表现出强烈的CLL肿瘤细胞与T淋巴细胞的相互作用，可作为研究CLL免疫微环境的实验动物模型[4]。

T细胞白血病/淋巴瘤1（TCL1）基因位于14q32.1，其染色体的易位和倒位与T细胞慢性淋巴细胞白血病/T细胞幼淋巴细胞白血病（T-CLL/T-PLL）的发病相关[5]–[6]，TCL1蛋白是癌基因TCL1的产物，其作为AKT激酶的共激活剂，在CLL和淋巴瘤的发生发展中起着重要作用[7]。人TCL1基因在体内（Em-TCL1）的外源性表达在免疫球蛋白重链可变区（IGHV）启动子和IGH增强子的控制下可导致CD5^+^ B细胞的克隆扩增[8]，基于TCL1基因的过表达，Eµ-TCL1转基因小鼠可在衰老后（通常为13～18个月）发展为类似于人类的CLL[9]，然而该模型成型周期较长。本研究通过同种异体移植的方法，利用Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞过继性转移（AT）至野生型（WT）小鼠体内，建立具有自身免疫功能且成模周期较短的动物模型。

材料与方法

一、实验动物

无特定病原体（SPF）级的C57BL/6J WT小鼠购于新疆医科大学动物实验中心，H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA基因敲入小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。本实验共采用20只6～8周，体重为19～25 g的C57BL/6J小鼠（8只雌鼠、12只雄鼠），实验前随机将小鼠分为2组，每组10只，其中4只雌鼠、6只雄鼠。一组以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠为受体小鼠，移植Eµ-TCL1转基因小鼠的脾细胞为AT组；一组以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠为WT组。本实验所用小鼠均饲养于环境温度为20～24 °C、环境湿度为50％～70％的SPF级动物房内，保持正常日光周期、垫料干燥、自由进食及饮水。所有操作均符合新疆医科大学动物实验中心伦理要求（批件号：20210301-169）。

二、利用CRISPR/Cas9技术构建H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA基因敲入小鼠

H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA基因敲入小鼠的构建委托江苏集萃药康生物科技股份有限公司完成，构建过程简述如下：基于CRISPR/Cas9技术原理，利用显微注射技术构建相应的打靶载体，并根据TCL1基因制备对应的gRNA、同时构建同源重组供体载体（Donor vector），将CRISPR/Cas9系统和Donor vector样品显微注射到C57BL/6J背景的小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内待其怀孕产仔；待受体小鼠生出的基因型为阳性的F0代小鼠性成熟后，与WT小鼠进行交配，得到聚合酶链反应（PCR）和测序鉴定阳性的F1代小鼠，基因敲入示意图见图1。基因型阳性F1代小鼠可用于保种建系，扩大种群，后代进行基因鉴定，基因型阳性者可作为供体小鼠。

H11-Eµ-VH-TCL1-β-globin-PolyA小鼠基因敲入示意图注 Kozak-ATG：Kozak序列-ATG起始密码子；HTCL1A CDS：人源TCL1A基因编码序列；Β-globin-PolyA：β-珠蛋白-PolyA信号序列；TGA：终止密码子

三、PCR鉴定小鼠基因型

剪取出生1周小鼠尾尖0.5 cm置于1.5 ml的EP管中，加入500 µl消化液和50 µl蛋白酶K溶液（试剂均购于北京索莱宝科技有限公司），将上述EP管放入55 °C恒温水浴锅消化过夜，待消化完全，使用无水乙醇沉淀提取法提取基因组DNA。反应体系25 µl：2×Mix 12.5 µl，正反向引物［引物通过NCBI网站设计（NCBI号：8115），由上海生工生物工程股份有限公司合成］各1.0 µl，模板DNA 1.0 µl，ddH_2_O 9.5 µl；引物序列如下：引物1：5′arm：正向序列（F）1 TTCAGCAAAACCTGGCTGTGGA，反向序列（R）1 AGCCTGGACTTTCGGTTTGGT；引物扩增片段大小为681 bp；引物2：3′arm：F2 CGTGGAGGACATGCTTCTCG，R2 TCTCTATTG GCAGTTTGACACATCC；引物扩增片段大小为647 bp；引物3：WT：F3 AGTCTTTCCCTTGCCTC TGCT，R3 GGGTCTTCCACCTTTCT TCAG；引物扩增片段大小为825 bp；PCR反应程序：预变性95 °C，5 min；变性95 °C，30 s；退火58 °C，30 s；延伸72 °C，30 s/kb；变性到延伸共35个循环；最后再延伸72 °C，5 min；10 °C维持保存。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。鉴定引物对应位点见图1。

四、Eµ-TCL1转基因小鼠AT模型的建立

以10月龄以上基因检测阳性的转基因小鼠为供体，取其脾，在两个磨砂载玻片之间的RPMI 1640培养基中分离组织、过滤。通过红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）裂解红细胞，然后在PBS中洗涤2次，细胞计数后将（2～4）×10^7^个脾细胞腹腔注射至6～8周性别对应的C57BL/6J WT小鼠体内。每周监测小鼠体重及一般情况，根据文献[10]及前期实验结果，在移植后第9周通过颈椎脱臼处死小鼠。

五、Eµ-TCL1转基因小鼠AT模型的鉴定

1. 病理表现：取每组小鼠脾、淋巴结、肝、肺、肾，观察其大小、颜色、质地等一般情况并称重。用4％多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）浸泡小鼠各脏器过夜，固定后的组织进行组织脱水。组织切片后进行苏木精-伊红（HE）（北京索莱宝科技有限公司）染色，光镜下观察病理改变。

2. 外周血白细胞变化：通过眼球取血取小鼠外周血不少于60 µl置于EDTA-K2抗凝管，通过白细胞稀释液（购于北京索莱宝科技有限公司）进行白细胞计数，对比AT组和WT组小鼠外周血白细胞数量。10 µl用于制备外周血涂片，其余样本通过流式细胞术观察小鼠外周血淋巴细胞变化。

3. 免疫表型：通过流式细胞术检测小鼠外周血、脾、骨髓中CD5^+^CD19^+^ B淋巴细胞数量变化情况及外周血中CD23、CD43、CD200、CD20、CD22、CD79b（抗体PE anti-mouse CD5、FITC anti-mouse CD19、APC anti-mouse CD23、PE/Cyanine anti-mouse CD43、PE anti-mouse CD200、APC/Cyanine7 anti-mouse CD20、APC anti-mouse CD22、PE anti-mouse CD79b均购于BioLegend, Inc.公司，美国）的表达情况。

六、统计学处理：所有数据均至少进行3个生物学重复，实验数据通过SPSS 26.0整理分析，计量资料用x±s表示，两组间比较采用t检验，统计数据采用GraphPad prism 10.2进行绘图。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、Eµ-TCL1转基因小鼠基因型鉴定

本实验中所用Eµ-TCL1转基因小鼠是以C57BL/6J为遗传背景的转基因小鼠，故本实验中以C57BL/6J为WT对照。WT小鼠样本在用引物3扩增后，可得一条825 bp的条带，而转基因小鼠样本则无对应条带。而利用引物1、2扩增后，转基因小鼠样本可分别得到一条681 bp和647 bp的条带，WT小鼠样本无对应条带，如图2所示，可知编号21、22、23、24、25、26、27的小鼠样本均含有目的基因。因此，本研究使用含目的基因的小鼠作为供体小鼠。

Eµ-TCL1转基因小鼠样本PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 A 引物1扩增产物条带（681 bp）；B 引物2扩增产物条带（647 bp）；C 引物3扩增产物条带（825 bp）注 Eµ-TCL1：免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1；条带从左到右依次为Marker（M）、野生型（WT）、编号为21、22、23、24、25、26、27小鼠样本的PCR产物条带

二、移植后小鼠一般情况

在对WT小鼠进行脾细胞移植后，WT组与AT组小鼠体重都呈现增长趋势，体重变化差异无统计学意义（P>0.05）。移植后第7周，AT组1只雌鼠死亡，其余小鼠无死亡。移植后第9周，肉眼观察AT组2只雌鼠活力下降、嗜睡，其中1只体型明显缩小、体重减轻。AT组雄鼠与WT组无明显差异。

三、小鼠白血病表现

1. 病理表现：处死小鼠后可观察到：AT组脾重量为（0.92±0.16）g、肝重量为（2.11±0.56）g；WT组脾重量为（0.06±0.01）g、肝重量为（1.42±0.13）g，AT组出现明显的肝（P＝0.006）、脾（P<0.05）肿大；肺、肾重量差异均无统计学意义（均P>0.05）。HE染色结果显示：AT组可见脾小淋巴细胞形成大小基本一致的结节，红白髓边界不清；正常淋巴结结构被分化成熟的小淋巴细胞弥漫浸润，可见淡染的假滤泡；骨髓增生活跃，淋巴细胞显著增多，可见间质、结节或弥漫性浸润，以上提示AT组淋巴细胞浸润至肝、肺、肾，如图3、4所示。

过继性转移（AT）组和野生型（WT）组小鼠脏器（×100，HE染色）注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

过继性转移（AT）组和野生型（WT）组小鼠脏器（×100，HE染色）注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

2. 外周血白细胞变化：AT组外周血白细胞计数较WT组明显增多［（124.33±8.74）×10^9^/L对（5.55±1.67）×10^9^/L，P＝0.002］。流式细胞术检测结果显示AT组外周血B淋巴细胞百分比较WT组增多［（69.13±6.88）％对（39.78±5.94）％，（P<0.05）］。显微镜观察外周血涂片显示，AT组小鼠较WT组外周血淋巴细胞增多，如图5所示。

过继性转移（AT）组和野生型（WT）组外周血涂片 A AT组外周血涂片低倍（×100）；B WT组外周血涂片低倍（×100）；C AT组外周血涂片高倍（×1 000）；D WT组外周血涂片高倍（×1 000）注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

3. 免疫表型：流式细胞术结果显示：AT组CD19^+^CD5^+^ B淋巴细胞占淋巴细胞百分比在外周血、骨髓和脾中分别为（61.37±9.92）％、（28.61±7.08）％、（86.03±5.78）％；WT组CD19^+^CD5^+^ B淋巴细胞占淋巴细胞百分比在外周血、骨髓和脾中分别为（4.51±1.32）％、（5.58±1.46）％、（14.33±3.22）％；AT组外周血、骨髓、脾中CD19^+^CD5^+^B淋巴细胞占淋巴细胞百分比较WT组增多，差异均具有统计学意义（均P<0.05），结果如图6所示；AT组外周血CD43、CD200表达阳性，如图7所示；AT组CD20、CD22、CD79b在B细胞上的表达低于WT组，结果如图8所示。

流式细胞术检测过继性转移（AT）组和野生型（WT）组CD19+CD5+ B淋巴细胞占淋巴细胞百分比 A AT组外周血CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；B WT组外周血CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；C AT组脾CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；D WT组脾CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；E AT组骨髓CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比；F WT组骨髓CD19+CD5+ B淋巴细胞占上一门细胞百分比注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

流式细胞术检测过继性转移（AT）组和野生型（WT）组外周血CD43和CD200的表达情况 A AT组外周血CD43表达情况；B AT组外周血CD200表达情况；C WT组外周血CD43表达情况；D WT组外周血CD200表达情况注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的WT小鼠

流式细胞术检测过继性转移（AT）组和野生型（WT）组外周血CD20、CD22和CD79b的表达情况 A AT组外周血CD20表达情况；B AT组外周血CD22表达情况；C AT组外周血CD79b表达情况；D WT组外周血CD20表达情况；E WT组外周血CD22表达情况；F WT组外周血CD79b表达情况注 AT组：移植了免疫球蛋白重链增强子调控的T细胞白血病/淋巴瘤1（Eµ-TCL1）转基因小鼠脾细胞的以C57BL/6J为遗传背景的野生型小鼠；WT组：未接受Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞移植的以C57BL/6J为遗传背景的野生型小鼠

讨论

本研究通过CRISPR/Cas9技术成功复刻了Eµ-TCL1转基因小鼠，经观察发现，该小鼠在7个月时，外周血涂片可见淋巴细胞增多；在13个月时，流式细胞术检测出现CD19^+^CD5^+^ B淋巴细胞比例明显增高，显微镜下观察外周血涂片淋巴细胞增多、白细胞计数增多，故该小鼠可在13个月以后自发进展为CLL，这与Bichi等[9]实验结果基本一致。

CLL淋巴细胞在体外几乎无自发增殖，且在离体培养时易发生细胞凋亡[11]。本实验中，Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞的体外培养并未获得扩大的细胞群，说明单纯免疫组织细胞共培养不能复现CLL淋巴细胞增殖所需微环境，Zanesi等[12]通过AT发现IgM^+^CD5^+^细胞能在小鼠体内蓄积，为本实验提供了理论基础。

CD5^+^ B淋巴细胞在外周血、骨髓和各免疫器官中进行恶性克隆性增殖是CLL的一个主要特征，CLL患者通常有体重减轻，肝、脾肿大等临床表现[13]。本研究解剖小鼠发现，AT组肝、脾均明显大于WT组；白细胞计数结果显示AT组外周血白细胞增多；外周血涂片发现AT组外周血成熟淋巴细胞增多；HE染色结果显示AT组小鼠脾小淋巴细胞形成大小基本一致的结节，红白髓边界不清，淋巴结中可见淡染的假滤泡、骨髓增生活跃，淋巴细胞显著增多以及出现淋巴细胞的非免疫器官浸润；流式细胞术显示AT组外周血、骨髓、脾中CD19^+^CD5^+^ B淋巴细胞大量蓄积。以上结果均表明，通过Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞AT方法构建的CLL小鼠模型已能够表现出CLL疾病的基本特征。

Eµ-TCL1转基因及AT组小鼠总体寿命情况：Eµ-TCL1转基因雌鼠中位生存期为367 d；AT组雌鼠中位生存期为73 d；Eµ-TCL1转基因雄鼠中位生存期为402 d，AT组雄鼠中位生存期为98 d。雌鼠寿命总体不及雄鼠长，Eµ-TCL1转基因小鼠患病时间通常为13～18个月，而构建的AT模型小鼠患病时间大大缩短（6～9周），且移植后受体小鼠外周血、脾和骨髓中CD19^+^CD5^+^ B淋巴细胞大量蓄积，蓄积程度大于供体小鼠，这可能提示，通过AT构建的CLL小鼠模型疾病程度高于Eµ-TCL1转基因小鼠且雌鼠疾病程度更为严重。有研究表明IGHV未突变的CLL患者疾病侵袭性更高[14]，而Eµ-TCL1转基因小鼠中B细胞受体显示出了其特征[15]，这提示Eµ-TCL1转基因小鼠疾病或更类似于人类侵袭性CLL；人类中含有MYC的染色体区域8q24的扩增与CLL患者的不良结局相关[16]，因此推测AT小鼠更为严重的疾病表现或与上述基因突变相关。为进一步研究该模型小鼠与人类CLL的差异，本实验完善了相关的免疫表型检测，结果发现，AT组3只雌鼠CD23表现为阴性、1只雄鼠CD23低表达，2只雌鼠CD20、CD22、CD79b表达水平明显高于WT组，CD43、CD200的表达情况基本符合人类CLL表达特点，后续实验中，将优化实验条件即在不存在需要立即采取行动的严重症状的情况下，在90％和100％的水平呈现疾病时对小鼠实施安乐死，期间对小鼠进行一般情况及疾病动态变化观察，并进一步探索转基因小鼠及其AT模型与人类CLL疾病进展的差异及机制。

通过异源性（如人源性CLL细胞）移植构造CLL小鼠模型周期较短（6～8周）[17]，但通常采用免疫缺陷鼠或实验前破坏小鼠自身免疫功能[2]–[3]，本研究采用鼠源性CLL细胞进行同种异体移植，为了避免发生免疫排斥反应（在本实验中免疫排斥反应可能会导致造模失败），采用与Eµ-TCL1转基因小鼠同遗传背景的C57BL/6J小鼠作为受体[18]，利用这种造模方式，CLL小鼠模型具有相对完整的免疫功能，且相对于Eµ-TCL1转基因小鼠，AT小鼠成模周期缩短，可提高实验效率，为CLL相关的免疫机制研究提供良好的临床前实验材料。

尽管Eµ-TCL1转基因小鼠及其AT模型保留了小鼠自身的免疫功能，但Eµ-TCL小鼠主要依赖TCL1癌基因过表达驱动B细胞恶性增殖[4]，而人类CLL的发病涉及多基因协同作用（如NOTCH1、SF3B1、TP53等高频突变）及染色体异常［如del（13q）、del（11q）］等[19]。有研究[20]表明实验室小鼠和人类在免疫细胞类型的相对丰度、基因表达模式以及特定基因功能方面存在显著差异。本研究缺乏对AT小鼠疾病的动态观察，在AT小鼠与Eµ-TCL1转基因小鼠发病及疾病表现差异方面未进行更深入的研究。因此，与人类CLL相比，本研究小鼠模型可能无法完全模拟复现CLL患者疾病进展中广泛存在的基因突变的累积、克隆演化过程以及微环境的重塑过程。

综上所述，利用Eµ-TCL1转基因小鼠脾细胞AT能在较短周期内成功制备CLL小鼠模型，为CLL发病、免疫及治疗等研究提供临床前模型。