Predictive Value of miRNAs Markers for Advanced Lung Squamous Cell Carcinoma

TL;DR

This study identifies a set of four miRNAs that can predict the prognosis of advanced lung squamous cell carcinoma patients with high accuracy.

Contribution

A novel miRNA-based biomarker with strong predictive value for advanced LUSC prognosis is proposed.

Findings

Four miRNAs (miR-377-3p, miR-4779, miR-6803-5p, miR-3960) were selected as a prognostic biomarker for advanced LUSC.

The combined AUC value of the four miRNAs was 0.865, indicating strong predictive power.

Target genes of the miRNAs are enriched in cancer-related signaling pathways like MAPK and kinase pathways.

Abstract

肺癌是全球癌症死亡的主要原因之一，约80%的肺癌属于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其中肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）在NSCLC中占据重要比例。尽管肿瘤的综合治疗极大提升了患者的总生存期，但晚期LUSC患者的预后较差。急需一种生物标志物来预测晚期LUSC患者的预后，以便通过早期诊断，改善预后。研究发现miRNAs在肺癌组织中差异表达，并作为潜在的致癌或抑癌基因发挥作用，本研究旨在筛选出早期和晚期LUSC差异表达的miRNAs，构建用于预测晚期LUSC患者预后的一组miRNAs标志物。

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库中下载LUSC患者临床信息及miRNAs的相关数据。应用生物信息学方法分析数据，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线，利用多种在线分析工具预测靶基因，分析靶基因的潜在生物学机制。

两组间共鉴定出58个差异表达的miRNAs。根据LASSO回归筛选出7个miRNAs拟构建miRNAs标志物，又根据每个miRNAs的ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）值，最终选取其中的4个mRNAs（miR-377-3p、miR-4779、miR-6803-5p、miR-3960）作为预测晚期LUSC患者的生物标志物。4个miRNAs联合的AUC值为0.865。富集分析显示这些靶基因富集在癌症通路、促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路、丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase, STK）及酪氨酸激酶信号通路等多种通路。

miR-377-3p、miR-4779、miR-6803-5p、miR-3960联合预测晚期LUSC患者预后能力良好，AUC可达0.865。

Clinical characteristics of research samples

Figures

差异表达的miRNAs的火山图

miRNAs标志物的构建。A：在LASSO分析中通过10倍交叉验证选择参数λ；B：7个差异表达miRNAs的LASSO回归系数谱。

miRNAs标志物的预测价值。A：miR-10a-5p；B：miR-377-3p；C：miR-580-5p；D：miR-1914-5p；E：miR-3960；F：miR-4779；G：miR-6803-5p；H：7个miRNAs联合；I：4个miRNAs（miR-377-3p+miR-4779+miR-6803-5p+miR-3960）联合。

4个miRNAs重叠靶基因的韦恩图。A：miR-377-3p；B：miR-4779；C：miR-3960；D：miR-6803-5p。

重叠靶基因的GO分析图。A：生物过程；B：细胞组分；C：分子功能。

KEGG分析图。A：条形图；B：气泡图。

网络图。A：20个核心基因的PPI网络图；B：miRNA和核心基因关系图。

Tables

表 1. 研究样本临床特征

Characteristics		Control group (n=33)	Experiment group (n=22)	P
Age (yr)	>65	25 (75.7%)	15 (68.7%)	0.570
	≤65	8 (24.3%)	7 (31.3%)
Gender	Male	15 (45.4%)	21 (95.4%)	0.132
	Female	18 (54.6%)	1 (4.6%)
T stage	T1-2	25 (75.7%)	5 (22.7%)	<0.001
	T3-4	8 (24.3%)	17 (77.3%)
N stage	N0-1	31 (93.9%)	4 (18.1%)	<0.001
	N2-3	2 (6.1%)	18 (81.9%)

Full text

微小RNAs（microRNAs, miRNAs）是一类具有调控功能、长度为19到24个核苷酸不等的非编码单链小RNAs，成熟的miRNAs产物是由较长的初级miRNAs（pri-miRNAs）转录物通过核糖核酸酶连续加工产生的^[1]^。它通常与靶信使RNA结合，在转录后水平调控基因表达^[2]^，参与包括发育、代谢、转移和免疫应答等在内的多种生物学过程^[2]^。人类癌症中发现的第一个miRNA来自于慢性淋巴细胞白血病的研究^[3]^。有证据^[3]^表明，包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在内的多种癌症中含有大量失调的miRNAs，并作为潜在的致癌基因或抑癌基因发挥关键生物学效应。分析这些miRNAs将极大促进癌症的早期诊断，提高患者的总生存期（overall survival, OS）。此外，miRNAs存在于癌症患者的循环核酸中，且在血浆中具有组织特异性和高度稳定性，并且血液样本易于获取且经济适用，这表明检测循环miRNAs可能是一种有效的非侵入性癌症诊断方法^[1,4]^ 。

肺癌是全球癌症死亡率最高的癌种^[4]^，其中NSCLC在肺癌中约占80%，而肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）是NSCLC的主要亚型之一，尤其以吸烟的男性患者更为常见^[5]^。虽然癌症治疗有重大突破，免疫检查点抑制剂和靶向治疗的发展极大延长了患者的生存时间^[6]^，但晚期肺癌仍具有较高的患病率和死亡率，手术仍是目前治疗肺癌的主要手段。早期和部分可手术治疗的IIIA期LUSC患者的5年生存率为20%-80%，而IV期LUSC患者的5年生存率仅为5%，但大多数LUSC患者确诊时已处于晚期，错过最佳治疗时机^[7]^，疾病相关死亡率高，因此，有必要寻找一种标志物来预测晚期LUSC患者的预后，通过早期诊断，改善肺癌患者的OS^[4]^，提高患者的生存质量。

癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA），旨在通过大规模基因组测序和数据分析，揭示癌症的分子机制，推动个性化癌症治疗和癌症研究。本研究的目的是通过TCGA数据库中LUSC的miRNAs的数据，筛选早期与晚期LUSC之间差异表达的miRNAs，并构建一组具有高特异性和敏感性的miRNAs生物标志物，用于预测晚期LUSC患者预后，并通过相关线上分析平台，进一步预测miRNAs靶基因及相关信号通路，为进一步探讨机制研究提供参考价值，并为LUSC的诊断和治疗提供了潜在的有效指标。

1 资料与方法

1.1 数据下载及处理

从TCGA公共数据库中下载LUSC患者相关的miRNAs数据信息和患者的临床信息（https://portal.gdc.cancer.gov/），最终筛选出患者478例，其中I-IIIA期可切除患者456例，IIIB期不可切除和IV期患者22例。纳入标准：（1）具有明确的肿瘤原发灶-淋巴结-转移（tumor-node-metastasis, TNM）分期；（2）既往未接受过抗肿瘤治疗。排除标准：（1）TNM分期不明确；（2）既往接受抗肿瘤治疗。按照纳入与排除标准，按照1:1.5的比例，从I-IIIA期患者中随机抽取33例患者，作为对照组；IIIB-IV期患者共22例，作为实验组。

1.2 差异表达miRNAs的筛选和miRNAs标志物的构建

使用R语言（4.3.2版本）和SPSS（26.0版本）进行数据分析并绘图。在R语言中应用“edgeR”对对照组和实验组的miRNAs表达数据进行差异分析，计算每个miRNA的倍数变化（fold change, FC），按照|log2 FC|>1和错误发现率（false discovery rate, FDR）<0.05的标准，筛选差异表达的miRNAs并得出上调和下调的miRNAs，通过LASSO回归，从差异表达的miRNAs中进一步筛选一组miRNAs。通过SPSS软件，运用Logistic回归和受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线绘制图像。得到一组用于预测晚期LUSC预后的miRNAs标志物。

1.3 靶基因预测及富集分析

使用TargetScan和miRWalk数据库预测每个miRNA的靶基因，并利用韦恩（Venn）图筛选交集靶基因。然后应用微生信等线上分析平台对获取的交集靶基因进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析。

1.4 构建蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络并筛选核心基因

应用String数据库绘制PPI网络，并应用Cytoscape软件的cytoHubba插件筛选潜在的关键基因，并构建核心基因PPI网络，对其进行可视化。并利用微生信等线上分析平台制作miRNAs与靶基因的网络，进行网络可视化。

1.5 统计学方法

采用R（4.3.2版）软件处理数据及生成图像。分类变量使用计数（n）和比例（%）表示，采用χ^2^检验进行比较。LASSO回归用于筛选miRNAs。SPSS软件绘制ROC曲线用来评估miRNAs标志物的预测能力。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的基线特征

从TCGA数据库中下载共478例LUSC患者的miRNAs数据信息，根据入组标准，共230例LUSC患者纳入研究，并通过随机抽样，最终确定两组样本数目，其中对照组33例、实验组22例。每个患者作为一个独立样本，检测出共2213种miRNAs，筛选去掉表达量低（表达量<0.5）的miRNAs，最终入组732个miRNAs，并根据每种miRNAs测序数据的每百万读数（reads per million, RPM）值，进行数据分析。患者临床信息见表1，两组之间的年龄和性别差异不具有统计学意义。

表 1: 研究样本临床特征

2.2 筛选差异表达的miRNAs

应用R软件中“edgeR”包分析对照组和实验组的miRNAs的差异性表达，共鉴定出58个差异表达的miRNAs，分析出上调的miRNAs有4个，下调的miRNAs有54个（图1）。

差异表达的miRNAs的火山图

2.3 初步构建miRNAs标志物

对58个miRNAs进行LASSO回归分析，根据回归分析所得曲线下面积（area under the curve, AUC）最大值，鉴定出7个miRNAs用于构建miRNAs标志物。这7个miRNAs包括miR-1914-5p、miR-377-3p、miR-580-5p、miR-4779、miR-3960、miR-6803-5p及miR-10a-5p（图2）。

miRNAs标志物的构建。A：在LASSO分析中通过10倍交叉验证选择参数λ；B：7个差异表达miRNAs的LASSO回归系数谱。

2.4 miRNAs标志物对晚期LUSC的预测价值

通过SPSS软件绘制ROC曲线（图3）评估miRNAs标志物对晚期LUSC的预测价值，7个miRNAs标志物的AUC为0.960（95%CI: 0.914-1.000, P<0.0001），7个miRNAs的AUC值分别为：miR-10a-5p为0.339（95%CI: 0.194-0.482），miR-377-3p为0.664（95%CI: 0.513-0.815），miR-580-5p为0.256（95%CI: 0.126-0.385），miR-1914-5p为0.433（95%CI: 0.281-0.584），miR-3960为0.579（95%CI: 0.416-0.741），miR-4779为0.696（95%CI: 0.542-0.849），miR-6803-5p为0.686（95%CI: 0.537-0.835），但由于miR-1914-5p、miR-580-5p和miR-10a-5p的AUC值均小于0.5，不具备应用价值，因此，针对其他4个miRNAs进一步绘制ROC曲线进行分析，4个miRNAs联合的AUC值可达0.865（95%CI: 0.763-0.967, P<0.0001），这表明4个miRNAs的组合仍具有区分晚期LUSC患者的价值。因此最终选取4个miRNAs（miR-377-3p、miR-4779、miR-3960、miR-6803-5p）作为预测晚期LUSC的标志物。

miRNAs标志物的预测价值。A：miR-10a-5p；B：miR-377-3p；C：miR-580-5p；D：miR-1914-5p；E：miR-3960；F：miR-4779；G：miR-6803-5p；H：7个miRNAs联合；I：4个miRNAs（miR-377-3p+miR-4779+miR-6803-5p+miR-3960）联合。

2.5 靶基因预测及富集分析

利用miRWalk和TargetScan数据库预测上述4个miRNAs的靶基因。运用韦恩图获取两个数据库中的交集靶基因，提高预测靶基因的精确性。miR-377-3p有42个重叠靶基因，miR-3960有99个重叠靶基因，miR-4779有968个重叠靶基因，miR-6803-5p有646个重叠靶基因（图4）。4个miRNAs共有1755个靶基因。然后，对1755个靶基因进行富集分析，以明确靶基因的生物学功能。

4个miRNAs重叠靶基因的韦恩图。A：miR-377-3p；B：miR-4779；C：miR-3960；D：miR-6803-5p。

借助微生信平台对1755个预测靶基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。GO分析结果显示（图5），差异表达的靶基因在生物学过程（biological process, BP）中富集在神经递质水平的调节、神经递质转运、跨突触信号的调节等相关过程；在细胞成分（cellular component, CC）分析结果表明，这些靶基因富集在谷氨酸能突触、神经肌肉接头、神经元对神经元突触等过程；分子功能（molecular function, MF）分析显示，靶基因富集在GTPase活化蛋白结合、磷脂酰肌醇结合、磷脂酰肌醇二磷酸结合、STK活性、蛋白酪氨酸激酶活化等过程。KEGG途径（图6）集中在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号通路、促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路、癌症中的蛋白聚糖等多种与癌症相关的途径中。这表明我们筛选的miRNAs在LUSC的发展过程中发挥了潜在的作用。

重叠靶基因的GO分析图。A：生物过程；B：细胞组分；C：分子功能。

KEGG分析图。A：条形图；B：气泡图。

2.6 PPI网络构建及核心基因筛选

利用Cytoscape软件的CytoHubba插件筛选出20个核心基因，构建核心基因的PPI网络（图7A），其中miR-377-3p与3个核心基因相关（EP300、AKT2、IGF1）；miR-3960与0个核心基因相关；miR-4779与12个核心基因相关（RPS6KB1、EGFR、GSK3B、SNAI1、STAT1、PIK3R1、RHOA、E2F1、CDKN1A、IGF1R、BCL2L11、CDC42）；miR-6803-5p与8个核心基因相关（AKT2、RELA、CDKN1A、KRAS、CREB1、IGF1、MDM2、TP53）（图7B）。

网络图。A：20个核心基因的PPI网络图；B：miRNA和核心基因关系图。

3 讨论

肺癌是全球大多数国家和地区癌症死亡的主要病因^[7]^。恶性肿瘤的早期检测可改善预后和生存率^[7]^，但大多数癌症发现时已处于晚期阶段，失去了手术治疗的机会，其预后通常较差。尽管组织活检是诊断肿瘤进展和转移的金标准^[7]^，但在癌症诊断中还需要更先进、更安全并且灵敏度和特异度高的方法来预测晚期LUSC的患者，为肺癌患者尽早提供手术时机，从而提高患者的OS，改善预后。

miRNAs与不同的细胞功能相关，控制着包括细胞增殖、分化和调控细胞死亡等在内的多种生物学过程^[8]^。miRNAs广泛参与基因表达和蛋白质的翻译环节，miRNAs通过调节癌基因和抑癌基因的表达，调控细胞增殖和细胞凋亡，从蛋白质、DNA和RNA水平上对肿瘤的发生、发展进行早期预警和预测，在肿瘤中发挥着潜在的作用^[9]^。另外，miRNAs作为一种理想的生物标志物，已经在乳腺癌、肺癌^[2,6]^、结直肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中取得重要进展。本研究基于TCGA数据库进行数据分析，筛选可用于预测晚期LUSC预后的miRNAs标志物。并通过线上分析平台，构建miRNA-Gene网络，探索相关靶基因的机制，确定潜在的生物标志物，以提高诊断的准确性。

以往的相关研究中，针对miRNAs的研究已经取得了显著成效。例如，miR-let-7在肺癌细胞中下调RAS、MYC和HMGA2基因的表达^[10]^，进一步抑制CDK6 mRNA表达，进而阻碍细胞周期的正常进程^[11]^。在NSCLC中，高表达miR-155和miR-let-7的患者预后较差^[12]^。而hsa-miR-126、hsa-miR-100、hsa-miR-145在肺癌中的表达水平较高，且与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）家族呈负相关^[12]^。miR-146b可以用于预测LUSC的OS，miR-211-3p、miR-3679-3p和miR-4787-5p是不同阶段LUSC的理想标志物^[11]^。miR-1247-3p表达量的高低与肝细胞癌患者的肺转移相关^[13]^。Hu等^[14]^鉴定了含有miR-1、miR-30d、miR-486和miR-499的4种血清miRNAs特征，其预示了不同分期（I-IIIA期）NSCLC的OS。另有一些miRNAs也被鉴定为某种癌症的生物标志物，例如，胰腺癌中的hsa-miR-21-5p、hsa-miR-23a-3p和hsa-miR-27a-3p^[15]^以及淋巴瘤中的hsa-miR-142-3p和hsa-miR-494-3p。

本研究通过TCGA数据库，分析出7个miRNAs：miR-377-3p、miR-3960、miR-4779、miR-6803-5p、miR-1914-5p、miR-580-5p、miR-10a-5p，又根据ROC曲线分析每个miRNA的AUC值，最终确定了miR-377-3p、miR-3960、miR-4779、miR-6803-5p的AUC值具有统计学意义，且4个miRNAs的总体预测值为0.865，表明4个miRNAs的组合仍具有预测晚期LUSC的价值。

根据以往的研究，我们筛选的4个miRNAs参与了多种癌症及其他疾病的生物学过程，在疾病的诊断、预后分析及治疗中发挥重要作用。miR-377-3p对多种癌症的发生发展乃至预后均产生一定影响。高表达的miR-377-3p在TP53突变的患者中总体存活率较差^[16]^，miR-377的下调与肠型壶腹周围腺癌的最佳预后相关。Yuan等^[17]^的一项关于黑色素瘤的研究表明miR-377-3p可以抑制黑色素瘤的生长。Sun等^[18]^发现lncRNA NEAT1可以通过抑制miR-377-3p的作用促进NSCLC的进展。这些研究均证实miR-377-3p参与了多种癌症的调控过程，并对肿瘤的侵袭和转移表现出负向或正向调控。另有研究^[19]^发现，miR-3960可以抑制膀胱癌进展。miR-3960参与三阴性乳腺癌患者对顺铂的耐药性^[20]^。由此，我们可以发现miRNAs在不同类型的癌症或其他疾病，以及疾病的不同阶段，甚至治疗中产生了复杂的调控作用，具体机制仍需进一步探索。

miRNAs有助于维持调节细胞命运的基因之间的平衡，并且它们的失调可以破坏这种平衡，在癌症的起始到转移性疾病的发展或进展中均发挥一定的作用。由于miRNAs能够靶向多个分子，且1个靶基因或靶mRNA可以接受多个miRNAs的调控，这就产生了一个复杂的miRNA-mRNA网络，其中特定miRNAs的生物学效应和特性不是可以通过线性关系解释的。调节miRNAs表达的优点是它们能够同时靶向各种基因和途径^[8]^。为了进一步研究miRNAs的机制，本研究通过miRWalk和TargetScan预测miRNAs的靶基因并获取交集靶基因，通过STRING和Cytoscape等线上分析软件，最终筛选了20个核心基因，包括CREB1、CDC42、TP53、KRAS、IGF1、IGF1R、CDKN1A、EGFR、SNAI1、GSK3B、AKT2、E2F1、RELA、EP300、PIK3R1、RPS6KB1、BCL2L11、STAT1、RHOA、MDM2。

本研究筛选的20个核心基因在多种癌症的发生发展中发挥了重要的生物学功能。TP53是重要的抑癌基因，在癌症发展中起到关键作用，它参与细胞周期的调控、DNA损伤修复及细胞凋亡在内的多种生物学过程。CDC42是Rho家族的成员之一，它负责信号通路的启动，参与癌症的致病过程，CDC42的过表达干扰Ras和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的活性，诱导细胞转化，从而导致肿瘤的发生和发展^[21]^。AKT是一种STK，是PI3K途径的关键下游介质，活化的AKT在细胞存活、细胞周期进展和细胞生长调节中发挥重要作用^[22]^。AKT2是AKT家族的成员，已有研究^[22]^证明野生型AKT2的异位表达导致人乳腺癌和卵巢癌细胞的侵袭和转移，被认为是潜在的治疗靶点。KRAS属于原癌基因RAS家族，KRAS突变刺激其介导的信号转导途径，导致肿瘤的发生、进展、细胞过度增殖以及恶性发展和侵袭^[23]^。PI3K/PTEN信号通路的失衡被认为是多种肿瘤发生中的关键分子事件之一，PIK3R1则是PI3K的主要调节亚型，PIK3R1的突变作为肿瘤的抑制基因或癌基因影响疾病进展。PIK3R1的突变、缺失或表达水平异常可以引起PI3K/AKT/mTOR通路的活化，从而促进细胞生长、存活、增殖和迁移^[24]^。MET基因在多种癌症中发生异常改变时，常与癌细胞异常增殖及侵袭能力增强密切相关^[25]^。CREB1是一种转录因子，发挥致癌作用，参与肿瘤细胞的增殖、存活和转移。CREB1在乳腺癌组织和转移性癌细胞中升高，与预后不良、转移和淋巴结受累相关，并可作为乳腺癌的潜在标志物^[26]^，而CREB1在大多数NSCLC细胞系中高度表达，并与NSCLC患者的生存率降低相关。通过充分了解CREB1和miRNAs的调控网络，CREB1和miRNAs具有作为人类癌症治疗靶点的潜力。NSCLC中IGF-1和IGF1R的上调和表达与肿瘤进展和患者预后相关。一项关于LUSC的研究^[27]^显示，与其他类型的癌症相比，LUSC中的IGF1R蛋白高表达与EGFR表达相关，并且高IGF1R基因拷贝数是手术切除NSCLC的独立预后因素。EGFR是多种miRNAs的靶点，miRNAs参与肺癌发生和靶向治疗的EGFR信号通路，近来受到越来越多的关注，miRNAs通过靶向EGFR信号通路在不同类型的癌症中发挥作用。最近在LUSC中也发现了miR-206对c-MET和EGFR致癌信号通路的这种双重抑制作用^[28]^。研究证实几种miRNAs可以作为生物标志物来预测肺癌患者对EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的反应^[29]^。另外，具有EGFR突变的根治性切除NSCLC患者比无EGFR突变NSCLC患者，miR-21和miR-10b均高表达^[30]^。另外，研究^[30]^证实越来越多的miRNAs与肺癌细胞对抗EGFR药物的耐药性相关，提示miRNAs可能成为抗EGFR药物治疗的新靶点，或将成为一项有前景的预测性生物标志物。这些研究表明，我们筛选miRNAs的核心靶基因在肿瘤的发展中起到重要作用，为后续关于miRNAs作用机制的探索提供了有价值的参考。

本研究基于数据库研究，对早期LUSC和晚期LUSC患者进行分析，得到一组miRNAs可以用来预测晚期LUSC的生物标志物，并对相关靶基因进行机制的探讨。基于先前针对miRNAs及其靶基因在各种癌症中的研究，我们认为本研究筛选出的miRNAs标志物可以用于晚期LUSC患者的早期诊断。但本研究的分析对象来自于数据库，并且尚未经过临床样本的分析验证，存在一定的局限性。且由于晚期LUSC样本数目的局限性，结果存在偏倚。此外，本研究根据miRNAs的表达量进行筛选，删除了表达量过低的miRNAs，减少了表达量过低的miRNAs对结果的干扰，但仍可能存在误差。另外多种混杂因素如人群、年龄和外部因素等都可以对最终结果产生影响，后续，我们会对临床样本进行严格的病例对照研究，进一步优化我们的miRNAs组合，并对其在生物学过程中的作用机制进行分析与讨论。

总之，肺癌由于其晚期确诊和治疗的有限性而具有高患病率和死亡率，miRNAs则是用于癌症的诊断和监测的一种理想标志物。另外，miRNAs稳定存在于患者的循环核酸中，具有组织特异性和高度稳定性，因此不仅作为诊断性生物标志物，甚至还可以作为治疗性和预后性生物标志物发挥着重要作用。虽然在miRNAs与癌症的相关性方面已经取得了许多进展，但进一步了解现有的形式和生物学功能，仍有许多难题需要进一步研究。