Standardization of the use of opsonized zymosan as stimulus in the 1,2,3-dihydrorhodamine technique for the assessment of neutrophil respiratory burst

TL;DR

This paper standardizes the use of opsonized zymosan in a technique to assess neutrophil respiratory burst, important for diagnosing chronic granulomatous disease.

Contribution

The study establishes 50 µg of opsonized zymosan as the optimal and reproducible stimulus for the 1,2,3-dihydrorhodamine technique.

Findings

Phorbol-12-myristate 13-acetate increased fluorescence intensity in healthy subjects.

50 µg of opsonized zymosan was found to be the optimal and reproducible stimulus.

The optimized technique is proposed for routine clinical diagnosis of chronic granulomatous disease.

Abstract

Chronic granulomatous disease is a defect in phagocytosis due to deficiency of gp91
phox
, p22
phox
, p47
phox
, p40
phox
, and p67
phox
(classic form of the disease). Recently, EROS and p40phox deficiency were described as responsible for the non-classical form of the disease. The 1,2,3-dihydrorhodamine oxidation technique, with phorbol-12-myristate 13-acetate as a stimulus, is performed to diagnose the classic chronic granulomatous disease. However, oxidation mediated by EROS and p40
phox
requires stimuli such as zymosan, Escherichia coli, or Staphylococcus aureus.

Estandarizar el estímulo con zimosán en la técnica de la 1,2,3-dihidrorrodamina para evaluar el estallido respiratorio del neutrófilo.

Se obtuvo sangre de cinco sujetos sanos previo consentimiento informado. Se utilizó la técnica de 1,2,3-dihidrorrodamina usando el forbol-12-miristato- 13-acetato como control y diferentes cantidades de zimosán opsonizado (150,100, 50, 20 y 10 µg). Por citometría de flujo, se obtuvo la intensidad de fluorescencia media de la rodamina 1,2,3 en las poblaciones de neutrófilos y se calculó el índice de oxidación. Se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov, ANOVA y el análisis post-hocóe Tukey. Se consideró un valor de p < 0,05 como estadísticamente significativo.

El forbol-12-miristato-13-acetato incrementó la intensidad de la fluorescencia media de la rodamina 1,2,3 en los sujetos sanos. Entre las diferentes condiciones de zimosán probadas, la de 50 µg fue la cantidad óptima y reproducible en todos los controles por el análisis estadístico y los hallazgos citométricos.

Se presenta la optimización de la técnica 1,2,3-dihidrorrodamina empleando el zimosán como estímulo. Se propone su implementación en los laboratorios de diagnóstico clínico como parte de la evaluación diagnóstica rutinaria de la enfermedad granulomatosa crónica.

Figures