Cytoplasmic light-chain immunofluorescence combined with FISH in bone marrow smears to detect cytogenetic abnormalities in multiple myeloma

TL;DR

This study compares New-FISH with other methods to detect genetic abnormalities in multiple myeloma patients, finding high consistency and effectiveness.

Contribution

New-FISH is shown to be a reliable alternative for detecting cytogenetic abnormalities in multiple myeloma.

Findings

New-FISH detected abnormalities in 100% of cases with no significant difference compared to cIg-FISH.

New-FISH showed consistent results with MACS-FISH for 1q21 amplification and IgH abnormalities.

t(4;14) was detected in 26.7% of patients with no difference between methods.

Abstract

分析骨髓涂片胞质轻链免疫荧光结合FISH技术（New-FISH）检测多发性骨髓瘤（MM）细胞遗传学异常的敏感性。

纳入南京医科大学第一附属医院2022年4月至2023年10月收治的42例MM患者，采用组合探针1q21/1p32、p53、IgH、IgH/FGFR3［t（4;14）］、IgH/MAF［t（14;16）］对患者同时进行New-FISH和CD138磁珠分选结合FISH（MACS-FISH）或胞质轻链免疫荧光结合FISH（cIg-FISH）检测，分析其细胞遗传学检测结果。

23例MM患者中，cIg-FISH法、New-FISH法异常检出率分别为95.7％、100.0％（P>0.05）。cIg-FISH法、New-FISH法对1q21扩增、1p32缺失、p53缺失、IgH异常的检出率一致，分别为52.2％、8.7％、17.4％、65.2％。进一步对IgH异常的患者进行t（4;14）、t（14;16）检测，t（4;14）阳性率为26.7％，t（14;16）未检出，两种方法检测结果相同。19例MM患者中，MACS-FISH法、New-FISH法异常检出率分别为73.7％、63.2％（P>0.05）。MACS-FISH法对1q21扩增、1p32缺失、IgH异常的检出率略高于New-FISH法，但差异均无统计学意义（P值均>0.05）。

New-FISH法对于MM患者细胞遗传学异常检出率较高，与MACS-FISH、cIg-FISH一致性较好。

Figures

1例患者骨髓涂片细胞形态（A）和骨髓标本经CD138磁珠分选后的细胞形态（B）（瑞氏-吉姆萨染色，×100）

骨髓涂片胞质轻链免疫荧光结合FISH典型荧光信号（×100） A 1q21扩增（信号模式：3R2G）；B 1p32缺失（信号模式：2R1G）；C p53缺失（信号模式：1R1G）；D IGH易位（信号模式：1R1G1F）；E IgH/FGFR3融合基因（信号模式：1R1G2F）注 R：红色信号；G：绿色信号；F：黄色信号（融合信号）

Full text

多发性骨髓瘤（MM）是一种克隆性浆细胞恶性增殖性疾病，骨髓中异常增生的浆细胞分泌单克隆免疫球蛋白或其片段，导致多种器官损伤[1]。蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、单克隆抗体及自体造血干细胞移植等治疗方法的发展显著改善了MM的预后，但疾病的复发、进展仍较为常见，因此评估MM预后并采取最佳治疗策略尤为重要[2]–[3]。遗传学异常是MM的主要预后因素。细胞遗传学核型分析异常检出率约20％，荧光原位杂交（FISH）技术具有较高的敏感性，可提高染色体核型异常检出率。FISH技术以检测MM的1q21扩增、p53缺失、IgH重排、t（4;14）、t（14;16）、t（11;14）等为主[4]–[6]。间期FISH不需要培养染色体中期分裂象，但易受到正常细胞污染，在浆细胞比例低的样本中检出率较低。目前，国内外骨髓瘤工作组均推荐应用CD138磁珠分选结合FISH（MACS-FISH）或胞质轻链免疫荧光结合FISH（cIg-FISH）提高异常检出率[7]–[8]。本研究应用骨髓涂片结合cIg-FISH（New-FISH）对MM常见细胞遗传学异常进行检测，探讨New-FISH对MM细胞遗传学异常的检出率。

病例与方法

1. 病例：纳入南京医科大学第一附属医院血液科2022年4月至2023年10月收治的42例MM患者，所有患者的诊断均符合国际骨髓瘤工作组相关诊断标准[9]。其中男21例，女21例，初治34例，治疗后8例，平均年龄67.5岁。临床分型：IgG型24例，IgA型6例，轻链型11例，不分泌型1例。

2. 染色体核型分析：取MM患者的骨髓液培养24 h后，根据标准方案收获骨髓细胞，并通过R显带技术分析核型。依据《国际人类细胞遗传学命名法（ISCN）2020》描述核型异常。每例患者至少分析20个中期分裂细胞，同时，每例标本至少需要2位医师共同鉴定其核型。

3. 单个核细胞提取：取适量淋巴细胞分离液置于离心管中，将患者骨髓液与等量PBS充分混匀后，沿管壁缓慢加于分离液液面上。然后将离心管置于离心机中，720×g离心15 min。离心后，管内分为3层：上层为血浆和PBS，下层为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，大多数单个核细胞悬浮于上、中层交界处，呈白膜状。吸取单个核细胞置于另一离心管中，加适量PBS，260×g离心5 min，弃上清，洗涤细胞3次。将细胞重悬于RPMI 1640培养液中，4 °C保存备用。

4. CD138免疫磁珠分选技术：取2～4 ml患者骨髓液，加入CD138磁珠50 µl/ml，4 °C孵育15 min，离心后去上清，过柱分离浆细胞，洗脱液洗脱分离柱上吸附的浆细胞。收获细胞后，置于4 °C保存备用。

5. 骨髓细胞形态学：骨髓涂片经瑞氏-吉姆萨染色后，对250个有核细胞进行分类，计数各阶段单克隆浆细胞在有核细胞中所占比例。骨髓瘤细胞常成堆分布，大小不一，形态呈多样性；核染色质较细致，有1～2个核仁，可见核畸形、双核、三核或多核浆细胞；胞质丰富，部分骨髓瘤细胞胞质中可见Rusell小体或者空泡。

6. FISH及信号分析：取磁珠分选后的细胞悬液或分离的单个核细胞悬液，使用细胞离心涂片机对两种细胞悬液进行分离制片，41×g离心4 min。New-FISH采用未经染色的骨髓涂片，若骨髓涂片已进行瑞氏-吉姆萨染色，需先进行脱色处理。将两种细胞悬液制备完成的玻片及骨髓涂片浸入100％乙醇中固定5 min，然后置于37 °C烘箱中过夜。三种玻片可储存于−20 °C，避免反复冻融。进行FISH检测时，三种玻片在90％甲酰胺溶液中静置5 min，依次经70％、85％、100％乙醇梯度脱水各2 min。晾干后，滴加配制的探针，置于杂交仪中，75 °C变性15 min，42 °C杂交16 h。经50％甲酰胺溶液、SSC缓冲液（2×）、0.1％ NP-40/PBS洗涤。MACS-FISH待玻片晾干后用DAPI进行复染。cIg-FISH及New-FISH进行胞质免疫染色，一抗为山羊抗人κ或λ轻链抗体，二抗为兔抗羊IgG荧光抗体。在荧光显微镜下分析100个浆细胞，计数阳性细胞比例。本实验室5种探针的阈值如下：1q21扩增/1p32缺失探针为20％，p53缺失探针为20％，IgH重排探针为10％，与IgH重排相关的IgH/FGFR3［t（4;14）］、IgH/MAF［t（14;16）］双色双融合检测探针为10％。

7. 统计学处理：采用SPSS 26.0软件进行数据分析，计数资料采用例数（％）描述，计量资料采用M（范围）描述，计数资料的比较采用χ^2^检验或Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 细胞遗传学及骨髓细胞形态学结果：42例患者中，7例（16.7％）未送检，26例（61.9％）为正常核型，1例（2.4％）为体质性异常，8例（19.0％）为异常复杂核型，其中3例为涉及多条染色体的非克隆性异常核型。骨髓细胞形态学显示，29例（69.0％）患者浆细胞比例≥5％，中位值为14.0％（5.2％～76.4％），浆细胞比例<5％的患者13例（31.0％），中位值为1.6％（0.4％～4.8％）。CD138磁珠分选后的细胞经瑞氏-吉姆萨染色后显示部分细胞被破坏，分选后的细胞包括浆细胞、中性粒细胞等（图1）。

1例患者骨髓涂片细胞形态（A）和骨髓标本经CD138磁珠分选后的细胞形态（B）（瑞氏-吉姆萨染色，×100）

2. New-FISH与cIg-FISH结果比较：同时采用cIg-FISH和New-FISH对23例患者进行1q21扩增/1p32缺失、p53缺失、IgH重排探针检测，结果表明，cIg-FISH组中22例（95.7％）患者有细胞遗传学异常，而New-FISH组中23例（100.0％）患者均检测出异常克隆，两者检出率的差异无统计学意义（P>0.05）。两种方法检测1q21扩增的检出率一致（52.2％，12/23），其中1例患者cIg-FISH显示正常而New-FISH检出1q21扩增，另1例患者cIg-FISH显示1q21扩增而New-FISH未检出。cIg-FISH组、New-FISH组1q21扩增阳性细胞比例的中位数分别为57.5％、62.5％。cIg-FISH检测出2例（8.7％）患者具有1p32缺失，异常细胞比例分别为74％、75％；New-FISH检测上述2例阳性患者也均为阳性，异常细胞比例分别为61％、82％。cIg-FISH法、New-FISH同时检出4例（17.4％）p53基因缺失阳性患者，异常细胞比例中位数分别为60％、65％。15例（65.2％）患者存在IgH基因部分缺失、部分扩增及重排，cIg-FISH、New-FISH均检测出异常克隆，异常细胞比例中位数分别为68％、72％。采用两种方法进一步对15例IgH异常的患者进行亚型分析，结果表明4例（26.7％）患者存在IgH/FGFR3［t（4;14）］异常，未检测出IgH/MAF［t（14;16）］异常，cIg-FISH组、New-FISH组t（4;14）异常细胞比例中位数分别为60.5％、83％。New-FISH法检测1q21扩增、1p32缺失、p53缺失、IgH异常、t（4;14）信号清晰，阳性模式典型（图2）。

骨髓涂片胞质轻链免疫荧光结合FISH典型荧光信号（×100） A 1q21扩增（信号模式：3R2G）；B 1p32缺失（信号模式：2R1G）；C p53缺失（信号模式：1R1G）；D IGH易位（信号模式：1R1G1F）；E IgH/FGFR3融合基因（信号模式：1R1G2F）注 R：红色信号；G：绿色信号；F：黄色信号（融合信号）

3. New-FISH与MACS-FISH结果比较：MACS-FISH法和New-FISH法异常检出率分别为73.7％、63.2％（P＝0.485）。两种检测方法均显示异常检出率最高的基因是IgH，MACS-FISH法检测出10例（52.6％）患者具有IgH基因部分缺失、部分扩增及重排，而New-FISH法仅检测出8例（42.1％）阳性患者，异常细胞比例中位数分别为82.5％、49.5％。MACS-FISH法、New-FISH法各检测出7例（36.8％）、6例（31.6％）患者具有1q21扩增，异常细胞比例中位数分别为83％、62％。MACS-FISH法检测出3例（15.8％）患者具有1p32缺失，异常细胞比例中位数为88％；New-FISH法仅检测出2例（10.5％）阳性患者，异常细胞比例分别为66％、67％。两种方法均显示p53缺失阳性患者1例（5.3％）。对IgH异常的患者进行亚型检测，两种方法均检测出3例t（4;14）异常患者。

4. 浆细胞比例与FISH检出率：本研究中骨髓涂片浆细胞≥5％的患者29例，23例同时采用cIg-FISH法和New-FISH法进行检测，有较高的一致性；6例同时采用MACS-FISH和New-FISH，两种方法的结果一致，其中5例阳性，1例阴性。对浆细胞比例较低（<5％）的MM亚组进行分析，13例患者同时采用MACS-FISH和New-FISH，异常检出率分别为69.2％、53.8％（P＝0.420）。2例患者MACS-FISH检测出阳性而New-FISH未检出，涉及1q21扩增、1p32缺失及IgH重排，1例患者1q21+、IgH重排阳性细胞比例分别为94％、90％，另1例患者1p32−、IgH重排阳性细胞比例分别为72％、86％，异常细胞比例较高，但浆细胞比例较低，2例患者分别为0.8％及4％。

讨论

细胞遗传学是影响MM患者预后的重要因素[10]。染色体核型分析和FISH为美国国立综合癌症网络指南及我国MM遗传学检测专家共识推荐的初诊MM的主要遗传学检测技术。多数MM患者具有复杂异常克隆，但因异常浆细胞有丝分裂指数低，传统的染色体核型分析常显示为正常核型。FISH技术可显著提高染色体核型分析异常的检出率，FISH技术包括间期FISH（D-FISH）、MACS-FISH、cIg-FISH[11]。D-FISH易受正常细胞干扰，呈假阴性，现应用较少。MACS-FISH、cIg-FISH分别通过富集浆细胞及标记浆细胞提高检测的敏感性，是常用的检测方法[12]–[13]。

进行染色体核型分析检测的35例MM患者中，仅发现8例伴异常核型，异常检出率与其他相关报道一致[14]。23例MM患者采用cIg-FISH法检测，异常检出率为95.7％。对19例患者进行MACS-FISH检测，73.7％的患者具有细胞遗传学异常。42例采用New-FISH法检测的MM患者中，83.3％患者检测出异常克隆。三种方法分别通过富集或识别浆细胞减少正常细胞的干扰，异常检出率均较高，但是三种方法各有优缺点。cIg-FISH技术通过提取单个核细胞制片后直接与探针杂交，缩短时间，节约成本，所需的样本量较少。但标本提取过程中会造成部分浆细胞损失，当患者浆细胞比例较低时导致最终判读的浆细胞数量不足。浆细胞含量越低，越需要进行浆细胞富集，本中心前期研究提示，当患者骨髓中浆细胞比例较低时，MACS-FISH检测方法更灵敏。CD138磁珠分选需要特殊的分选磁珠及分选设备，成本较高，费时；由于分选过程中有细胞损失，需要的标本量较多，当浆细胞含量较低时，所需标本量更多。同时，CD138磁珠分选会造成部分浆细胞破裂。本研究采用的新方法无需提取单个核细胞或者磁珠分选，仅需确定患者的轻链类型，选择合适的抗体即可，操作简单；实验室检查中，第一管标本用于骨髓涂片，相较于后抽取的标本，未经稀释，浆细胞比例较高，同时骨髓直接涂片可尽量保持浆细胞形态完整；若MM患者初诊时因诊断不明未留取骨髓标本，需要进行回顾性检测时，可选取留存的骨髓涂片进行New-FISH检测，分析其细胞遗传学异常；若MM患者骨髓浆细胞比例较高，一张骨髓涂片上可进行分区多点杂交。但当骨髓涂片浆细胞比例较低时，结果易呈现假阴性，并且需扩大杂交区域才能计数足够的浆细胞，此时更推荐MACS-FISH检测。

1q21扩增及1p32缺失被认为是MM的独立预后不良因素，其中，1q21扩增是MM患者最常见的细胞遗传学异常[15]–[16]。同时采用cIg-FISH法、New-FISH法的23例患者中，1q21扩增的检出率一致，为52.2％。采用MACS-FISH法、New-FISH法检测的19例患者中，1q21扩增阳性率分别为36.8％、31.6％，略低于相关研究报道[17]。1p32缺失的发生率较低，cIg-FISH法、New-FISH法同时检测出2例MM患者具有1p32缺失，而MACS-FISH法、New-FISH法分别检测出3例、2例。p53基因缺失是高危MM的标志，但其发生率较低[18]。本研究用p53探针对23例患者同时进行cIg-FISH和New-FISH检测，检出率为17.4％；对19例患者同时进行MACS-FISH和New-FISH检测，检出率为5.3％。涉及14q32的易位是MM患者检出率最高的基因异常，与其发生易位的染色体较多，t（11;14）、t（4;14）、t（14;16）较常见，t（4;14）、t（14;16）阳性的MM患者预后不良[19]。本中心在临床检测中发现，当IgH基因出现部分缺失或部分扩增时，也可能与4、11、16号染色体等发生易位。因此，若IgH基因存在上述情况，均进行亚型分析。本研究中，cIg-FISH和New-FISH同时检出65.2％的患者存在IgH基因部分缺失、部分扩增及重排，进一步亚型分析发现，26.7％的患者t（4;14）阳性，未检出t（14;16）。MACS-FISH和New-FISH分别检出10例、8例患者具有上述IgH基因异常，其中，两种方法均检出3例患者具有t（4;14）异常。

本研究首次提出骨髓涂片结合cIg-FISH方法用于MM患者细胞遗传学检测，该方法检出率较高，与现有的MACS-FISH、cIg-FISH方法一致性较好，具有一定的应用前景。但是，在结果分析时，需要准确识别浆细胞并排除杂信号干扰。同时，该方法对涂片质量要求较高，涂片中的细胞需均匀分布。总之，与经典的cIg-FISH及MACS-FISH相比，New-FISH显示出较好的检测能力，是临床中值得推广的检测MM细胞遗传学异常的新方法。